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蛋白電泳測量運(yùn)用計(jì)算機(jī)掃描法

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蛋白電泳測量運(yùn)用計(jì)算機(jī)掃描法

本文作者:林林、何廣源 單位:曾廣東省順德中醫(yī)院檢驗(yàn)科

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源

取自陸軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科常規(guī)檢查健康人血清30份。

1.2儀器與試劑

電泳儀1套;計(jì)算機(jī)(帶有Windows操作系統(tǒng)和安裝Adopephotoshop及Excel等軟件)1臺(tái),掃描儀1臺(tái)(光學(xué)分辨率在1000dpi,吸光度2.8以上)醋酸纖維薄膜等。巴比妥緩沖液(pH8.6離子強(qiáng)度為0.06mol/L);配置好后用1mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH值至8.6。染色液:0.1%氨基黑10B,漂洗液:取蒸餾水800mL、甲醇50mL及冰醋酸150mL混合而成。透明液:石蠟油透明液。

1.3操作

參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》蛋白電泳操作方法[1],對點(diǎn)樣和透明掃描幾個(gè)步驟加以改進(jìn)。

1.3.1自行制備點(diǎn)樣器

(1)常規(guī)分析(剪切后用NaOH浸泡洗脫比色法):先用砂輪將蓋玻片打磨平滑,再用兩塊載玻片夾住蓋玻片,露出1cm,用透明膠紙綁緊就成了一個(gè)很好的加樣器了。(2)掃描法:把蓋玻片截掉一半,用同樣的方法綁緊。或者剪取3cm×1cm的濾紙條,加樣效果也不錯(cuò)。

1.3.2透明

將脫色吹干后的薄膜浸入透明液中,約10min薄膜完全透明,然后將膜條置于潔凈、干燥的玻璃板或透明膠片上[2-3]。

1.3.3掃描

用高分辨率掃描儀透射掃描薄膜[4],分別對血清中清蛋白(ALB)及α1、α2、β、γ球蛋白5種成分進(jìn)行掃描分析。掃描條件為500dpi,保存為RBG模式tiff文件。

1.3.4應(yīng)用

Adopephotoshop軟件,將每個(gè)圖像分10×100個(gè)區(qū)間,并用ImageTool圖像分析軟件分析信息參數(shù)分別記錄各區(qū)間的C、N、Y、K、∑、R、L、a、b等圖像色譜參數(shù)數(shù)據(jù),將上述參數(shù)導(dǎo)入Excel電子表格中,運(yùn)用Excel的引入函數(shù),插入圖表,識(shí)別低段等功能,可以畫出蛋白質(zhì)組分分布曲線,百分含量。

1.4方法學(xué)評(píng)價(jià)

采用配對數(shù)據(jù)t檢驗(yàn),以陸軍總醫(yī)院Sebia全自動(dòng)蛋白電泳分析儀為參照,分別比較掃描法和常規(guī)法與Sebia蛋白電泳儀檢測結(jié)果之間的差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

掃描法和常規(guī)法與Sebia蛋白電泳儀檢測結(jié)果之間的差異分別見表1、2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,掃描分析測定法與Sebia蛋白電泳儀檢測結(jié)果不存在差異,以Sebia全自動(dòng)蛋白電泳儀檢測結(jié)果為參照,掃描分析測定法在方法學(xué)上,可以接受,各項(xiàng)t值均小于常規(guī)法,而且在操作上省去了剪切、洗脫、比色等煩瑣工夫,避免因此而帶來的誤差。

3討論

3.1本實(shí)驗(yàn)方法在電泳的前期操作與改良的常規(guī)方法一樣[5],后期的檢測法是根據(jù)電泳圖譜的色深(吸光度值)直接反映了該區(qū)帶蛋白質(zhì)的含量,透明膠片的色深與數(shù)字化圖譜的RBG信息參數(shù)呈反相關(guān),與油墨量∑和L(灰度)呈正比(用油墨量∑為參數(shù)的分析結(jié)果與Sebia結(jié)果最為符合)。由于蛋白分析是測其相對含量,通過分析其色譜參數(shù)可計(jì)算出蛋白各組分的相對含量百分比。采用了計(jì)算機(jī)Adopephotoshop應(yīng)用軟件和ImageTool圖像分析軟件(試用版)以及Excel電子表格統(tǒng)計(jì)軟件分析系統(tǒng),但現(xiàn)在幾種軟件中的綜合使用會(huì)帶來工作量的增加,分析時(shí)間較長,離實(shí)際應(yīng)用還有一段距離,這要求檢驗(yàn)人員必須與軟件專業(yè)人員一起自行研究編寫一種應(yīng)用。軟件該軟件能直接將圖像色譜信息參數(shù)記錄下來,并用相應(yīng)的計(jì)算分析軟件(可以是Excel,也可以是其他數(shù)據(jù)分析軟件)分析圖像色譜參數(shù),從而計(jì)算出蛋白質(zhì)各組分的百分含量,真正做到圖像處理、分析、計(jì)算一體,其經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益是非常有前景的。

3.2蛋白電泳的分離效果直接影響到分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,因此往后研究工作的重點(diǎn)在提高電泳的分離質(zhì)量[6]??偨Y(jié)起來,主要有如下幾方面:(1)是電泳支持物的選擇上,可以比較瓊脂糖凝膠與醋纖維膜的分離效果和穩(wěn)定性。(2)是加樣的方法上可以借鑒全自動(dòng)蛋白電泳儀的加樣裝置,選擇質(zhì)地均勻、吸水性能好、蛋白質(zhì)電滲作用小的濾紙,當(dāng)然還要考慮硬度和厚度等因素,可制成一排多個(gè)標(biāo)本的加樣器。(3)是可購買較高配置的電泳儀,使電泳電流、電壓穩(wěn)定,增大可調(diào)電壓范圍。