蛋白酶抑制劑精選(九篇)
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第1篇：蛋白酶抑制劑范文
【關(guān)鍵詞】 豆豉；，，胰蛋白酶抑制劑；，，分離純化；，，降糖作用
摘要：目的從豆豉中提取胰蛋白酶抑制劑，并探討其降血糖活性。方法以永川豆豉為材料，經(jīng)脫脂，酸性溶液提取，硫酸銨沉淀得到胰蛋白酶抑制劑粗提物，再經(jīng)Sephadex G-75凝膠層析得到純化的胰蛋白酶抑制劑，以純化的胰蛋白酶抑制劑給糖尿病小鼠灌胃并觀察其降血糖活性。結(jié)果從豆豉里分離出的胰蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶的抑制率為30%~40%；用抑制劑提取液給四氧嘧啶糖尿病模型小鼠連續(xù)灌胃4 d，發(fā)現(xiàn)其血糖值明顯低于模型組；觀察小鼠的胰組織病理切片，與糖尿病小鼠比較，灌胃后的小鼠胰組織明顯得到修復。結(jié)論 豆豉提取液有較明顯的降糖作用。
關(guān)鍵詞：豆豉； 胰蛋白酶抑制劑； 分離純化； 降糖作用
Purification A Trypsin Inhibitor from Lobster Sauce Produced in Yongchuan and Hypoglycemic Action of Research
Abstract：ObjectiveTo isolate and purify the trypsin inhibitor from Lobster sauce and investigate its hypoglycemic action.MethodsA trypsin inhibitor was purified from the lobster sauce of Yong Chuan by defatting，extraction with axidic buffer，precipitation，chromatography on Sephadex G-75， and its hypoglycemic action in mice was studied.Results A series study on lobster sauce showed that the inhibitor had inhibition activity of thirty~forty percent to trypsin. In mesoxalyl carbamide model，the blood glucose levels were reduced after four days treated with lobster sauce extracts of Yong Chuan， compared with the model group.ConclusionThe trypsin inhibitor has hypoglycemic action.
Key words：Lobster saace； Trypsin inhibitor； Isolation and purification； Hypoglycemic action
蛋白酶抑制劑廣泛存在于動植物和微生物中，具有抑制蛋白酶的活性的作用，能與相應(yīng)的蛋白酶水解，參與體內(nèi)許多重要生理過程的調(diào)節(jié)。其中胰蛋白酶抑制劑具有重要的藥用價值，對于急性胰腺炎、肺氣腫、出血性和敗血性休克等疾病有獨特的療效［1］。蛋白酶抑制劑被認為是植物天然的自我防御體系，是植物抗病基因工程的重要目的基因來源［2］。大豆胰蛋白酶抑制劑（STI）與其它臨床上廣泛應(yīng)用的胰蛋白酶抑制劑具有相似的性質(zhì)，但其生理活性研究還沒得到足夠的重視。和其他胰蛋白酶抑制劑相比，大豆胰蛋白酶抑制劑具有分子量較小、免疫反應(yīng)較弱、植物來源的抑制劑能避免攜帶動物病毒、原料來源廣、價格低廉等優(yōu)點，應(yīng)當?shù)玫阶銐虻闹匾暋４蠖挂鹊鞍酌敢种苿┑姆N類有7~10種，目前研究證明主要有兩種在動植物體內(nèi)能抑制胰蛋白酶活力：一種為鮑曼克抑制劑(BBI)，是由71個氨基酸組成的多肽，分子量為7 975，分子內(nèi)有7個二硫鍵，另一個為庫尼茲抑制劑（KSTI），分子量約2萬，分子內(nèi)有2個二硫鍵。近年來國外報道發(fā)現(xiàn)低濃度的BBI在動物體內(nèi)對直腸癌、肝癌等多種癌癥有抑制作用；另有報道大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)可能有一定效果［3］，但未見有降血糖作用的詳盡報道。因此，對具有強抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑制劑，從豆豉中分離純化，使其成為抗癌、治療糖尿病及其并發(fā)癥的新藥用于臨床，有十分積極的意義。
1 儀器與材料
DS1高速組織搗碎機（上海標本模型廠）， KDC1042離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），722分光光度儀（上海精密科學儀器有限公司），AE240電子天平（METTLER公司）；雄性昆明種小鼠（體重18~22 g），永川豆豉(市售咸豆豉) ，透析袋，牛胰蛋白酶(1∶250) 、BAPNA?HCl(購自上海維思科貿(mào)有限公司)， Tris( 成都化學試劑廠生產(chǎn))，sephadexG75 (上?；瘜W試劑廠生產(chǎn))，四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司)，葡萄糖試劑盒GLU（氧化酶法，液體，北京北化康泰臨床試劑有限公司），肝素鈉（天津生物化學制藥廠），其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 豆豉胰蛋白酶抑制劑的分離純化
2.1.1 豆豉胰蛋白酶抑制劑粗提物的制備大豆胰蛋白酶抑制劑的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋白酶抑制劑對熱酸環(huán)境相對穩(wěn)定，一般采用水浸酸提、沉淀再經(jīng)離子交換或凝膠層析純化制得。取2 kg永川豆豉，于46℃恒溫干燥9 h，干燥后置于干凈托盤中，把干燥豆豉粉碎、稱重，然后加入去離子水2 L，于0℃提取15 h。15 h后于3 000 r/min離心6 min，沉淀棄去， 收集上清液。取上清液，加入正己烷［正己烷∶上清液(1∶2)］，靜置30 min，后用1 000 ml的分液漏斗分離上述混合液，回收正己烷，收集棕色豆豉提取液。用稀鹽酸20%(v/v)調(diào)豆豉提取液的pH約為4，于55℃水浴中保溫1 h。稱取固體硫酸銨，分次少量加入于水浴的上清液里，使硫酸銨的飽和度為30%，繼續(xù)于55℃的水浴恒溫15 min，離心15 min（3 800 r/min），棄去沉淀，留上清液。在上清液里加固體硫酸銨，使硫酸銨的飽和度為55%，55℃保溫10 min，再離心15 min，棄去沉淀，收集上清液。再于上清液里加固體硫酸銨，使硫酸銨溶液的飽和度為70%，55℃恒溫10 min，離心30 min（12 000 r/min），棄去上清液，收集沉淀，用20 ml磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）溶解沉淀，沉淀即為抑制劑粗提物［4］，于4℃保存在冰箱里。
2.1.2 抑制劑粗提物的透析將抑制劑粗提物置于透析袋中蒸餾水充分透析7 d，除去鹽分。
2.1.3 凝膠柱的制備及抑制劑粗提物的純化［5］取層析柱（16 mm×60 cm)洗干凈并烘干。稱取12.5 g sephadex G75溶解在250 ml 0.05 mol?L-1 pH 7.8的磷酸緩沖液中，充分混勻后，在100℃水浴中蒸煮5 h，趕走氣泡，將凝膠連續(xù)沿壁緩緩倒入層析柱中，待有2 cm沉淀后，打開柱子下端的出口。穩(wěn)定以后在凝膠的上緣留2~3 cm緩沖液，并放一個面積相當?shù)臑V紙片，吸出存留緩沖液，加入5 ml樣品，連上緩沖液，打開出口閥，控制流速在2 ml/h。流出30 ml后，用干凈的試管分部收集（2~3 ml），檢測每管的抑制劑活性。
2.1.4 BAPNA法測定胰蛋白酶抑制劑活性 參考文獻［6］略加改進，取不同胰蛋白酶抑制劑制備物并與0.2 ml胰蛋白酶溶液（0.1mg/ml）混合，于5 ml TrisHCl緩沖液（pH 8.0，0.05 mol?L-1）中37℃保溫5 min，加入BAPNA 2.5 ml（5 mmol?L-1），于37℃恒溫10 min，立即加入0.5 ml 33%醋酸溶液終止反應(yīng)，以不加抑制劑的試樣做對照，410 nm處測定吸光度值。每降低0.1個A410 nm為一個BCTI抑制活性單位（U）。
圖1 豆豉胰蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶的抑制率（略）
由圖1可看到純化過的豆豉胰蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶的抑制作用是較強的，是一種抑制力較強的抑制劑。
2.2 抑制劑提取物對小鼠血糖水平的影響
2.2.1 實驗性四氧嘧啶糖尿病動物模型的建立取雄性昆明種小鼠（體重18~22 g），隨機分為3組。每組10只，分別為正常對照組、四氧嘧啶高血糖模型組、抑制劑提取物灌胃組。高血糖模型組及高血糖模型灌胃組禁食10 h。按200 ml/kg的用量，腹腔注射四氧嘧啶。72 h后人工斷尾取血，選取空腹血糖值大于11.0 mol?L-1的小鼠作為高血糖模型小鼠。
2.2.2 豆豉胰蛋白酶抑制劑對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平的影響高血糖模型灌胃組按每天0.3 ml/只用量經(jīng)口服灌胃給藥4 d。正常組和高血糖模型組每天注射等劑量的生理鹽水。每日觀察小鼠皮毛、活動等生長情況。末次給藥后，所有動物禁食10 h，按試劑盒方法測定血糖值。
表1 豆豉胰蛋白酶抑制劑對四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖水平的影響（略）
P＜0.001
由表1可見，第1天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型組有所降低，第4天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型組明顯降低，說明豆豉胰蛋白酶抑制劑提取物有較明顯的降血糖作用。
2.2.3 豆豉胰蛋白酶抑制劑對胰組織的影響處死小鼠，分別取四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃前后的胰腺組織做病理切片（HE染色），顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2~3。 由圖2~3可見，四氧嘧啶高血糖模型小鼠胰組織嚴重病變，灌胃后小鼠胰組織形態(tài)好于四氧嘧啶高血糖模型組織，胰島結(jié)構(gòu)較清晰，邊緣與周圍腺胞界限明顯。說明豆豉胰蛋白酶抑制劑提取液對胰島組織有明顯的修復作用。
圖2 抑制劑灌胃后小鼠胰組織 （略）
圖3 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰組織（略）
3 討論
據(jù)報道大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)有一定效果。我們在實驗中觀察到豆豉胰蛋白酶抑制劑提取液有降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的作用。我們尚在本實驗中做了豆豉胰蛋白酶抑制劑對α-葡萄糖苷酶活性抑制實驗，結(jié)果顯示無抑制活性作用。提示其降糖機理可能不是通過影響胰島素受體后糖代謝的環(huán)節(jié)，而可能是通過保護或修復胰島β細胞及胰島組織促進胰島素分泌或釋放起作用的［7］?？赡苁嵌刽崛∫褐幸鹊鞍酌敢种苿σ认佼a(chǎn)生了一定作用，促進胰島素的釋放，從而降低了血液中葡萄糖的濃度，但降糖作用機理尚有待再進一步分析研究。
參考文獻
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第2篇：蛋白酶抑制劑范文
【關(guān)鍵詞】 魚腥草 胰蛋白酶抑制劑 正交實驗
Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction procedure for trypsin inhibitor from Houttuynia cordata Thunb.．MethodsThe inhibition rate of trypsin activity was used as screening parameter， we employed the orthogonal design method to test the effects of four factors， including temperature of extraction solution (A)， volume of extraction solution (B)， pH value of extraction solution(C) and time of extraction (D)， on the extraction of trypsin inhibitor.ResultsFactor B performed the most significant effect on the extraction， and factors A and C came the next and factor D the last. ConclusionThe optimum extraction technology is A1B2C3D2 when the inhibition ratio of trypsin activity is considered as preferential parameter.
Key words:Houttuynia cordata Thunb.; Trypsin inhibitor; Orthogonal design
蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor， PI）是一類能夠抑制蛋白水解酶活性的物質(zhì)，廣泛存在于動植物和微生物中［1］。其中胰蛋白酶抑制劑（Trypsin inhibitor， TI）具有重要的藥用價值，對急性胰腺炎、肺氣腫、抗休克、防治腦水腫和腦缺血等都有很好的臨床治療效果，還有研究表明對 HIV 和腫瘤的治療也有重要意義［2］。因此，從傳統(tǒng)中藥中篩選具有TI活性的材料有很廣闊的應(yīng)用前景和市場價值。
魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的地上部分，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋之功效，是臨床應(yīng)用極其廣泛的中藥之一［3］。本實驗根據(jù)前期篩選的結(jié)果，利用魚腥草為材料對從魚腥草中提取TI的工藝進行優(yōu)化，找出最佳的提取條件，為今后的工業(yè)化生產(chǎn)TI提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。
1 儀器與試劑
1.1 試劑胰蛋白酶( 北京麒麟宏偉公司) 、大豆蛋白酶抑制劑（國藥集團化學試劑有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺（BAPNA）（上海三杰生物技術(shù)有限公司）、三-羥甲基-氨基甲烷、無水氯化鈣、鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉等為國產(chǎn)分析純；魚腥草。
1.2 儀器可見光分光光度計(7202B) 、離心機（LD-4） 、精密pH 計、水浴鍋、精密電子天平（FA2004N）。
2 方法
2.1 魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交實驗設(shè)計根據(jù)文獻［4～6］及預實驗結(jié)果，本實驗采用雙蒸水作為提取TI的溶劑。稱取干燥的魚腥草全草5 g，粉碎，在平行操作條件下，選用L9(34)正交實驗表進行提取實驗，以胰蛋白酶活性大小為指標，進行9次實驗，每次實驗重復3次（正交因素水平見表1），然后過濾并收集濾液，減壓濃縮到100 ml。 表1 因素水平（略）
2.2 魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分對胰蛋白酶的抑制率測定方法采用苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺（BAPNA）法［7］：取胰蛋白酶液1 ml，加藥材提取液1 ml在37℃水浴保溫5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保溫10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）終止反應(yīng)，用分光光度法在410 nm條件下測定吸光度。按下列公式計算樣品提取液的抑制百分率：i=(Ar-Abr )-(As-Abs)(Ar-Abr)×100%
式中：i —抑制百分率；Ar —標準溶液的吸光度；Abr—含標準溶液的空白對照液的吸光度；As—樣品溶液的吸光度；Abs—含樣品溶液的空白對照液的吸光度。
3 結(jié)果與方差分析
結(jié)果見表2，表3。由方差分析可知，各因素對提取效果的影響程度依次為B>A>C>D，其中因素B為高度顯著，因素A，C影響顯著，因素D沒有統(tǒng)計學意義，對試驗結(jié)果的影響很小。由R值可知， 各因素對試驗結(jié)果的重要次序為B>C>A>D。考慮到規(guī)?；a(chǎn)中經(jīng)濟、效率等因素，本文優(yōu)選工藝A1B2C3D2， 即在60℃，用30倍量水， pH值為9，3 h/次為最佳提取工藝。按照此工藝條件進行3次平行實驗，測定提取液對胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果平均抑制率為58.27%，表明本實驗確定的工藝路線穩(wěn)定可靠。表2 L9(34)正交實驗結(jié)果（略）表3 正交實驗的方差分析（略）
4 討論
因素A對實驗結(jié)果有顯著的影響，60℃時提取活性最高，隨著溫度的上升抑制率有下降的趨勢，說明隨著溫度的上升對TI有失活的作用。因素B對實驗有高度顯著的影響，在所有因素中影響最顯著，說明隨著溶劑量的增加會提高TI的提取效率，但從變化趨勢看當30倍量時繼續(xù)增加溶劑量，TI的提取率增幅不是很明顯，因此考慮生產(chǎn)成本和效益用30倍量是最好的。因素C對實驗結(jié)果也有顯著影響，隨著pH值的增加，提取活性成分的提取率增加，這說明在堿性條件下提取效率升高。
本實驗通過正交實驗法對提取工藝條件進行了優(yōu)化， 并按最佳工藝進行了驗證試驗， 結(jié)果證明用該工藝作為魚腥草中TI的有效部位的粗提取，具有工藝簡單、提取率高、操作控制容易、穩(wěn)定性好的特點。
【參考文獻】
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第3篇：蛋白酶抑制劑范文
【關(guān)鍵詞】 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1； 慢性乙型肝炎； 肝纖維化； 診斷； 酶聯(lián)免疫吸附測定
Clinical Application of Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1 in Assessment of Liver Fibrosis/SHI Yu-ling.// Medical Innovation of China，2012，9(23):087-089
【Abstract】 Objective：To evaluate the clinical value of TIMP-1 for diagnosis liver fibrosis. Method: CHB patients were divided into mild liver fibrosis group (S0-S1) and significant liver fibrosis group (S2-S4)， according to pathological diagnosis. The diagnostic capacity of CTGF was assessed by comparing the area under receiver operating characteristic (AUC) with a panel of fibrosis markers.Result：Serum level of TIMP-1 in control group，S0-S1，S2-S4 was(146.6±29.2)，(161.2±43.2)，(221.6±93.8)μg/L，respectively. The level of TIMP-1 in S2-S4 group was significantly higher than that of S0-S1 group (t=5.32，P
【Key words】 Tissue inhibitor of metalloproteinases-1; Chronic hepatitis B; Liver cirrhosis; Diagnosis; Enzyme-linked immunosorbent assay
First-author’s address:The First People Hospital of Xiangcheng ， Xiangcheng 466200，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.23.056
有研究發(fā)現(xiàn)，血清基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中有重要作用[1]。為了評估血清TIMP-1在肝纖維化中的診斷價值，筆者測定了肝纖維化患者血清中TIMP-1的含量，將肝穿刺病理學檢查作為金標準，使用ROC曲線分析TIMP-1診斷明顯纖維化的臨床價值，并和肝纖維化標記物HA、PCⅢ、CⅣ、LN比較其診斷性能。
第4篇：蛋白酶抑制劑范文
[關(guān)鍵詞] 血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；血清視黃醇結(jié)合蛋白；腎損害
[中圖分類號] R544.1+4；R587.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）01（b）-049-02
Analysis on early diagnosis of hypertensive and type 2 diabetes nephropathies with cystatin C and retinol binding protein
SHAO Yaoming NI Fangying MA Jian WANG Qiong
Department of Laboratory Medicine, Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Jiangsu Province, Wuxi 214023, China
[Abstract] Objective To explore the clinical significance of determining cystatin C (Cys C) and retinol binding protein (RBP) in diagnosis of early renal damage in patients with hypertension and type 2 diabetes. Methods Cys C and RBP were detected in 185 hypertension patients and 193 type 2 diabetes patients and 30 controls with auto chemistry analyzer, BUN and SCr were detected at the same time. Results Cys C and RBP in patients with hypertension and type 2 diabetes group were increased significantly compared with those of the control group (P < 0.01); but there was no significant of BUN and SCr among the three groups (P > 0.05). Conclusion Cys C and RBP are good diagnostic markers of early renal damage in patients with hypertension and type 2 diabetes. The combined examination of Cys C and RBP can be more helpful for the diagnosis of early renal damage.
[Key words] Cystatin C; Retinol binding protein; Renal damage
腎臟是人體的重要器官，也是原發(fā)性高血壓及2型糖尿病常會累及的臟器。腎臟病變的早期階段是一種非常隱匿的病理過程，進展緩慢，又無特異性的臨床表現(xiàn)。腎小球濾過率（GFR）是評價腎功能的重要指標，血BUN、SCr是臨床常用的濾過功能指標，但BUN、SCr受多種因素影響，并不能敏感和精確地反映GFR，特別是腎功能輕度損傷時，血BUN、SCr的變化并不明顯。臨床實踐證明：只有當50%以上的有效腎單位受到損害時BUN、SCr才高于正常值。有研究結(jié)果表明，血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（Cys C）和血清視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）反映腎小球濾過率明顯優(yōu)于血BUN、SCr[1]。本資料通過對原發(fā)性高血壓患者及2型糖尿病患者血清Cys C、RBP的聯(lián)合檢測，與血清BUN、SCr指標比較，探討血清Cys C、RBP在者腎損害早期診斷中的應(yīng)用價值。
1 資料與方法
1.1 一般資料
高血壓組185例患者中，男103例，女82例；年齡30～75歲，平均（48±18）歲；病程5~28年，均為我院心血管內(nèi)科就診患者，符合WHO/ISH1999原發(fā)性高血壓診斷標準。2型糖尿病組193例患者中，男103例，女90例；年齡33～78歲，平均（51±13）歲；病程5~30年，均為我院內(nèi)分泌科就診患者，符合美國糖尿病學會（ADA）2002年2型糖尿病診斷標準。對照組30例均為我院體檢中心健康體檢者，男16例，女14例，年齡25～72歲。均排除繼發(fā)性高血壓、腎疾病、自身免疫病、1型糖尿病及其他心腦血管疾病。三組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。
1.2 方法
高血壓組、2型糖尿病組及對照組患者均空腹14 h，清晨采集靜脈血4 mL，離心后取血清，采用Beckman-Coulter全自動生化分析儀檢測血清Cys C、RBP、BUN、SCr，試劑、質(zhì)控品、定標品均為公司原裝配套產(chǎn)品；同時取晨尿3 mL采用羅氏公司U411尿液分析儀作尿常規(guī)蛋白定性分析，試劑、定標品均為公司原裝配套產(chǎn)品。
1.3 統(tǒng)計學方法
采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P ＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2.1 血清 Cys C、RBP、BUN、SCr檢測結(jié)果比較
高血壓組、2型糖尿病組患者血清BUN、SCr與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；血清Cys C、RBP與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；高血壓組與2型糖尿病組患者血清BUN、SCr、Cys C、RBP比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。
表1 三組血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、視黃醇結(jié)合蛋白、尿素氮、
肌酐結(jié)果比較（x±s）
注：與對照組比較，*P < 0.01
2.2 患者尿蛋白定性血清Cys C、RBP、BUN、SCr的陽性率比較
原發(fā)性高血壓、2型糖尿病患者尿常規(guī)蛋白定性、血清BUN、SCr的陽性率較低，血清Cys C、RBP陽性率較高，聯(lián)合檢測陽性率更高。見表2。
表2 患者尿蛋白定性血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、視黃醇結(jié)合蛋白、尿素氮、肌酐的陽性率比較（%）
注：與尿蛋白定性比較，*P < 0.01；與BUN比較，#P < 0.01；與SCr比較，@P < 0.01；與Cys C+RBP比較，P < 0.01
3 討論
原發(fā)性高血壓及2型糖尿病均是嚴重威脅人類健康的慢性疾病，原發(fā)性高血壓病理過程主要表現(xiàn)為血管重構(gòu)和動脈粥樣硬化，2型糖尿病主要引起微血管病變，腎臟損傷是兩種疾病常見的并發(fā)癥。臨床準確的測定及客觀估計腎功能對早期腎損害的診斷有重要價值。近年來研究表明血清Cys C和RBP與腎臟GFR有良好的相關(guān)性。
Cys C是近年發(fā)現(xiàn)的血漿內(nèi)源性小分子微量蛋白，由122個氨基酸組成，屬堿性非糖基化蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為133 359，等電點（PI）為9.3，Cys C由人體內(nèi)有核細胞產(chǎn)生，生產(chǎn)較穩(wěn)定，不受個體、肌肉量、性別、年齡、腎前因素和慢性炎癥的影響。由于其相對分子質(zhì)量低，能自由濾過腎小球，在近端腎小管上皮細胞被分解代謝，不被腎小管重吸收和分泌，其血液中的濃度主要由GFR決定，是理想反映GFR的內(nèi)源性標志物。腎臟受損情況下，GFR減低，從而導致血中Cys C水平顯著升高[2]。
RBP是肝臟合成的視黃醇（維生素A）轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛分布于人體血清、腦脊液、尿液[6]。人體內(nèi)RBP 90% 與視黃醇結(jié)合為holo-RBP，未結(jié)合的游離RBP相對分子量蛋白較低，可自由通過腎小球濾過膜[3]。85％ holo-RBP與TTR結(jié)合，形成大分子物質(zhì)，不被腎小球濾過，15％部分經(jīng)腎小球濾過。因此，當腎臟濾過功能受損害時，血中RBP水平會明顯增高[4]。
臨床較常以尿蛋白定性或血清BUN、SCr的變化來了解腎臟早期損傷情況，由于尿蛋白定性靈敏度較低，尿中檢出蛋白時腎臟已有顯著受損；血清BUN、SCr個體差異較大，受年齡、性別、飲食等多重因素影響，血清BUN、SCr發(fā)生變化常提示腎臟損傷較嚴重，本研究中BUN、SCr升高的高血壓及2型糖尿病患者GFR已明顯降低，因此，不能以尿蛋白定性、血清BUN、SCr作為早期腎損傷的診斷指標。本實驗表明：高血壓及2型糖尿病患者血清BUN、SCr濃度與對照組無顯著差異時，血清Cys C和RBP的含量已顯著增高，表明BUN和SCr正常的高血壓及2型糖尿病患者，其腎小球功能在已開始受損，結(jié)果與國外相關(guān)研究基本一致[5-6]。從表2可以看出，高血壓及2型糖尿病患者尿蛋白定性、BUN和SCr檢出率僅為8.20%、7.14%、9.79％；而血清Cys C和RBP的檢出率分別為37.83%、33.60%，明顯高于前者。血清Cys C和RBP聯(lián)合應(yīng)用的測出率高達52.38％。
綜上所述，血清Cys C和RBP的聯(lián)合檢測對臨床早期診斷、早期治療原發(fā)性高血壓腎損傷具有較大的實用價值。
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第5篇：蛋白酶抑制劑范文
【關(guān)鍵詞】骨關(guān)節(jié)炎；軟骨；MMP和TIMP
【中圖分類號】R684.3 【文獻標識碼】B 【文章編號】1004-7484（2014）01-0029-02
1 簡介
骨關(guān)節(jié)炎（OA） 是一種慢性退行性疾病，是引起關(guān)節(jié)疼痛和殘疾的主要原因[1]。其特征是關(guān)節(jié)軟骨的破壞導致關(guān)節(jié)功能障礙。這種破壞主要是由于軟骨中降解細胞外基質(zhì)（ECM）大分子的蛋白水解酶活性的升高。長期以來一直在探討基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與疾病發(fā)生和潛在治療靶點之間的確切相關(guān)性，并混淆了它們在許多疾病病理方面的廣泛作用。
軟骨基質(zhì)由兩個主要的ECM成分組成：II型膠原纖維和軟骨可聚蛋白聚糖類（約各占45%），還有一些其他含量較少的大分子物質(zhì)[2]。在正常軟骨中，軟骨細胞會把合成的大量II型膠原、蛋白多糖等物質(zhì)分泌到ECM中，構(gòu)成細胞外纖維網(wǎng)架，給細胞提供支持與保護。這些物質(zhì)同時被軟骨細胞分泌的MMPs降解，維持軟骨細胞內(nèi)外動態(tài)平衡。關(guān)節(jié)軟骨損傷時，軟骨細胞分泌大量的MMPs對ECM進行降解，軟骨細胞失去膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)支持而破壞，導致OA的發(fā)生。
2 MMPs：破壞的主宰者？
MMPs屬于金屬蛋白酶含鋅超家族成員，來源于關(guān)節(jié)的固有細胞和浸潤細胞，包括膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、基質(zhì)溶解素、膜型MMPs和其他分泌型MMP。MMPs最初是以降解基質(zhì)的蛋白水解酶為特性的，但最近的研究表明它們作用于ECM還可以釋放生長因子或產(chǎn)生新的配體[3]。MMPs也可以從載體蛋白中釋放生長因子，激活蛋白酶抑制劑，并激活或滅活炎性細胞因子和炎性趨化因子[3]。因此它們在骨形態(tài)發(fā)生、骨重塑、傷口愈合和血管生成中有重要作用。大多數(shù)情況下，MMPs還有可能參與組織的正常生物過程，如修復和重塑[4]。在OA中，組織試圖修復損傷、控制炎癥和感染，但過程可能并不完整。這種'落空'的修復伴隨基質(zhì)更新和細胞表面以及胞周分子的調(diào)節(jié)，可能導致MMPs活性的不平衡，因此造成了組織的破壞。與非關(guān)節(jié)炎軟骨相比，OA關(guān)節(jié)軟骨中的MMP-1、MMP-3、MMP-13，MMP-28均升高。關(guān)節(jié)軟骨的周期性壓力負荷可增加MMP-3和MMP-13的表達和活化[5]，甚至單一的壓力損傷都可增加MMP-3和TIMP-1mRNAs的表達水平[6]。關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定、老化、氧化刺激也促進軟骨基質(zhì)的分解。對于造成軟骨損傷的MMPs來說，內(nèi)源性TIMP的水平并不過量。TIMPs是組織中的主要抑制劑。Woessner等[7]在1995年的研究中發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎中軟骨的退變本質(zhì)上是MMPs和TIMP的不平衡造成的。在各種OA動物模型中應(yīng)用合成型TIMP預防軟骨和骨蛋白水解的實驗[8]均支持金屬蛋白酶破壞骨關(guān)節(jié)功能的理論。
3 TIMP的臨床試驗
一些在動物模型中顯示出療效的TIMP已被用于臨床試驗，但都未能在OA疾病中顯示出明顯療效[8]。在某些病歷中，這些抑制劑還出現(xiàn)了不良反應(yīng)，如肌肉骨骼疼痛和肌腱炎、輕度貧血、肝酶升高等，主要是由于抑制劑缺乏特異性。人類基因組中有50多個與人類金屬蛋白酶密切相關(guān)的堿性活性中心的類似結(jié)構(gòu)，在一定程度上可以使它們對相同抑制劑敏感。我們對這些酶類的精確功能還了解甚少，但有些動物模型研究正在證明它們在生物學中的重要性，但抑制其活性的結(jié)果還不確定。例如，小鼠MMP14基因缺失可引起關(guān)節(jié)炎樣癥狀。在注射Ⅱ型膠原蛋白和脂質(zhì)多糖的單克隆抗體后，MMP-2基因敲除小鼠比野生型小鼠的關(guān)節(jié)炎更嚴重；在關(guān)節(jié)失穩(wěn)的模型中MMP-3基因敲除小鼠比野生型更易發(fā)生OA。這些觀察結(jié)果所強調(diào)的概念是，高度特異性抑制劑對避免毒副作用是有必要的?；谶@個原因，進一步開發(fā)金屬蛋白酶抑制劑的另一個先決條件是對靶酶的準確識別。
4 研發(fā)選擇性TIMP的提議
MMPs的活性受到三個水平的調(diào)節(jié)，即基因轉(zhuǎn)錄水平、無活性酶前體的蛋白水解作用和特異性抑制因子TIMP?？筎NF抗體和IL-1受體拮抗劑可有效地減少MMPs[9]。由于對金屬蛋白酶基因表達的復雜調(diào)節(jié)機制仍然缺乏充分的認識，所以并未建立起MMPs信號肽或轉(zhuǎn)錄水平的有效調(diào)控。此外，也有人擔心，抑制這些水平的同時也可能會影響正常細胞的運行。在OA中，有多種刺激素和細胞信號通路誘導MMPs的表達或激活，軟骨細胞是這些破壞性酶的主要細胞來源。在這種情況下，使用合成型TIMP對預防疾病進展可能是有效的。在與S1'底物結(jié)合袋牢固結(jié)合的高度選擇性MMP-13抑制劑方面已得到了最新進展[10]。
開發(fā)特異性抑制劑的另一種方法是TIMPs。到目前為止，在人類中發(fā)現(xiàn)4種抑制所有MMPs的TIMPs表達，即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4，但TIMP-1對某些膜型MMPs的抑制作用較弱。TIMP-MMP復合結(jié)晶物為開發(fā)更具特異性的TIMPs提供了線索。TIMP分子有一個與MMP相互作用的脊狀擴展位點。這個區(qū)域位于MMPs的活性位點，也就是N-末端Cys1殘基的氨基和羰基基團，與鋅酶活性位點螯合。圍繞TIMPs反應(yīng)性脊狀區(qū)域的突變可改變其特異性，也就是特殊MMPs的選擇性。例如，TIMP-3或Thr2Gly的N-末端突變可干擾TIMP-3對MMPs的抑制活性[11]。Chung等[12]報告了膠原酶血紅素域裂解三倍螺旋膠原蛋白的一個絕對必要條件，表明輔助域可能是開發(fā)變構(gòu)或外部抑制劑的一個好靶點，可能會比傳統(tǒng)活性位點抑制劑表現(xiàn)出更高的特異性。
5 結(jié)論
OA中的MMPs升高，毫無疑問會在OA疾病進展中導致軟骨和骨破壞。但TIMP并不能有效地治療OA。其原因還不清楚，但可能是由于抑制金屬蛋白酶是正常關(guān)節(jié)生理活動和動態(tài)平衡所必不可少的。OA時出現(xiàn)由MMPs引起的軟骨基質(zhì)漸進性破壞。通過TIMP或使用降低金屬蛋白酶合成但又不影響基質(zhì)合成的制劑來減少基質(zhì)的降解率，可能是行之有效的。產(chǎn)生金屬蛋白酶的天然抑制劑包括雷公藤內(nèi)酯醇，多酚和三萜類。多西環(huán)素是一種基質(zhì)金屬蛋白酶活性的弱抑制，并抑制一些MMP的產(chǎn)生，已用于牙周疾病的治療。一項最近的試驗中表明，使用多西環(huán)素治療單側(cè)膝關(guān)節(jié)OA患者可延緩關(guān)節(jié)間隙變窄[13]。但并不清楚多西環(huán)素是否可以有效地抑制金屬蛋白酶的活性或者還有其他活性。
研制新型TIMP不僅需要其更具特異性，還應(yīng)具備毒副作用小的條件。外部或變構(gòu)抑制劑對多種蛋白酶都有活性，但需要進一步研究以了解OA中來自于不同細胞的MMPs的功能。因此，提高TIMP的靶向性是一種行之有效的方法。此外，在臨床試驗中，還需要能有效監(jiān)測TIMP臨床療效的方法。我們相信這些困難是可以克服的，因為伴隨TIMP早期臨床試驗的失敗，我們對這方面知識的了解在迅速地增加。隨著許多有用的研究工具和技術(shù)的產(chǎn)生[14]，我們最終會得到一個有價值的治療實體。
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第6篇：蛋白酶抑制劑范文
【關(guān)鍵詞】 ACEI TPK 尿微量白蛋白
為探討如何能夠更有效地延緩及逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病(DN)的發(fā)展，本研究對60 例早期DN患者臨床觀察，其中60 例使用依那普利聯(lián)合胰激肽原酶(怡開)治療早期DN，觀察12周，通過檢測尿微量白蛋白(UAER)，效果滿意，報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
采集2005年10月—2006年12月住院患者，按照WHO(1999)糖尿病診斷標準，共納入60 例超重體型2型糖尿病患者。用隨機排列表法等分對照組30 例，聯(lián)合治療組30 例，兩組患者年齡、性別、體重指數(shù)、FBG、HbALc、血壓、UAER等基本匹配。主要觀察指標為尿微量白蛋白。1周內(nèi)檢測3次以上(酶聯(lián)免疫法)均在30～300 mg/24 h之間，全部病歷均除外急慢性腎炎、泌尿系感染、發(fā)熱、嚴重心肝腦疾患等其他引起蛋白尿的因素。一般情況比較見表1。表1 兩組患者一般情況比較
1.2 治療方法
所有被選患者均給予糖尿病常規(guī)綜合治療，包括飲食和運動治療，并根據(jù)病情選用口服降糖藥物或胰島素強化治療，使血糖控制在穩(wěn)定水平(空腹＜7.0 mmol/L，餐后2 h＜11.1 mmol/L)，伴高血壓者根據(jù)血壓調(diào)整依那普利劑量，使血糖控制在＜130/80 mm Hg(1 mm Hg＝0.133 kPa)。對照組使用依那普利(揚子江藥業(yè)集團有限公司)5～20 mg，每日2次口服，聯(lián)合治療組在對照組治療的基礎(chǔ)上加用怡開(常州生化千紅制藥有限公司)240 U，每日3次口服。療程12周。
1.3 觀察項目
治療前后分別檢測患者24 h尿微量白蛋白。
1.4 統(tǒng)計學方法
用SPSS軟件完成計量治療，以±s表示，組間差異以t檢驗測定P值，率間比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異顯著性。
2 結(jié)
果
對照組UAER由治療前的(255.6±51.72) mg/24 h下降到治療后的(105.50±36.82) mg/24 h(P＜0.01)，聯(lián)合治療組UAER由治療前的(276.12±59.11) mg/24 h下降到治療后的(69.10±29.91) mg/24 h(P＜0.01)，分別下降了37.6％0和66.30％，與對照組相比，聯(lián)合治療組效果更顯著(P＜0.01)。治療期間，使用依那普利有2 例咳嗽，但可耐受，未退出研究，尚未發(fā)現(xiàn)怡開毒副作用。
3 討
論
糖尿病腎病是糖尿病患者主要的微血管并發(fā)癥，發(fā)病機制包括多元醇通路的激活、蛋白非酶氧化和蛋白激酶的激活，血管活性物質(zhì)的活性過度、激肽系統(tǒng)活性不足等［1］。其中腎內(nèi)血流動力學和腎小球微循環(huán)與DN有著極為密切的關(guān)系，除了高血糖對腎臟的損害，激肽系統(tǒng)與腎素血管緊張素系統(tǒng)不同程度的異常改變［2］，使糖尿病患者體內(nèi)腎素血管緊張素系統(tǒng)活性增高，其血管加壓作用直接參與了腎臟的進行性損害。它通過影響全身及腎臟局部的血液動力學，升高腎小球內(nèi)壓力，使腎小球血漿流量增加，高灌注可導致腎小球入球小動脈擴張，腎小球超濾壓增高，從而使蛋白漏出增加，并引起濾過膜增厚，腎小球毛細血管閉塞，腎小球硬化。多數(shù)研究證實血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)降低血液中AngⅡ水平，阻斷AngⅡ在DN發(fā)生發(fā)展中的不良作用，特別是ACEI擴張出球小動脈作用明顯超過入球小動脈，可降低腎小球內(nèi)壓，進而降低尿白蛋白的排泄，起到腎保護作用，且有不依賴于血壓的降尿白蛋白效應(yīng)［3］，通過抑制腎小球系膜細胞纖維母細胞的過度增生及肥大，減輕腎間質(zhì)纖維化的過程［4，5］。ACEI同時可抑制激肽酶Ⅱ的活性，降低激肽的分解，增加激肽系統(tǒng)活性，增加腎血流灌注，改善腎臟功能。胰激肽原酶能夠改善血管平滑肌使小血管和毛細血管擴展，增加毛細血管血流量，改善微循環(huán)，恢復腎毛細血管的正常功能，并且激活金屬蛋白酶(原酶)水解腎小球系膜區(qū)和基底膜區(qū)的細胞外基質(zhì)在系膜區(qū)和基底膜區(qū)堆積。水解膠原防止基底膜增厚，延緩糖尿病腎病的形成。本研究中兩組治療前后UAER均明顯下降，但ACEI聯(lián)合TPR療效更加顯著?；诩る南到y(tǒng)與腎上腺血管緊張素系統(tǒng)(RASS)系統(tǒng)的相互協(xié)調(diào)，共同維持腎臟血流動力學穩(wěn)定和糖尿病時兩系統(tǒng)不同程度的異常改變，故RASS系統(tǒng)的阻斷及緩激肽原酶系統(tǒng)(KKS)系統(tǒng)活性的增加，使激肽的產(chǎn)生提高和降解減少，是ACEI和TKP腎保護的共同途徑，加之ACEI和TKP各自特有的腎保護作用，得以早期DN有效控制，二者聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出穩(wěn)定的協(xié)同效應(yīng)。依那普利在使用中有2 例咳嗽，但可耐受，未退出研究，怡開無明顯毒副作用。
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第7篇：蛋白酶抑制劑范文
子宮內(nèi)膜異位癥(Endometrosis，EMs)是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮肌層以外的部位出現(xiàn)、生長、浸潤、反復出血，以子宮內(nèi)膜細胞異位生長為特征。主要影響生育年齡的婦女，是目前常見的婦科疾病之一，近年來發(fā)病率明顯增高，約占婦女人口的10%～15%，在生育年齡的婦女中發(fā)病率高達30%［1］。EMs為良性病變，但其某些生物學行為卻類似惡性行為，尤其是具有組織侵襲、遠處種植生長的能力?？梢鹜唇?jīng)和不孕，嚴重困擾著廣大婦女的身心健康。EMs一直是婦科領(lǐng)域的難治之癥，國內(nèi)外婦產(chǎn)科學者一直在努力探索其發(fā)病機制，但至今尚無定論。研究證明，子宮內(nèi)膜碎片(腺上皮及間質(zhì))必須通過粘附、侵襲和血管形成，才可以生存、生長，并引起病變和癥狀。目前，很多研究也是從粘附，侵襲以及血管形成相關(guān)因子著手，試圖發(fā)現(xiàn)EMs的發(fā)病機制。其中主要的相關(guān)因子包括整合素家族相關(guān)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(metrix metalloproteinase，MMPs)及組織金屬蛋白酶抑制劑( tissueinhibitors of metalloproteinase， TIMPs)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(KDR)，而這些也是EMs發(fā)生機制中的研究熱點，本文就MMP及其TIMP在EMs中的研究進展作一綜述。
1 MMPs和TIMPs
MMPs是一組調(diào)節(jié)復雜，鈣及鋅依賴的中型蛋白酶家族，是細胞外基質(zhì)降解過程中的重要酶類。MMPs的活性調(diào)節(jié)在組織重建、炎癥及腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用。在正常穩(wěn)態(tài)組織中MMPs表達量極少，而在炎性細胞因子、激素、生長因子刺激下其表達量上升，從而在許多生理及病理過程中扮演重要角色。根據(jù)結(jié)構(gòu)的同源性和底物的特異性MMPs被分為五類（1）膠原酶類：如MMP1。（2）明膠酶：如MMP2和MMP9。（3）基質(zhì)裂解酶：如MMP3，MMP10，這類酶可以降解基底膜的許多成分和蛋白多糖反應(yīng)蛋白質(zhì)核心。（4）模型蛋白酶：如MMP14，MMP15，是一組與膜關(guān)聯(lián)的MMPs。（5）其他：如2000年在子宮內(nèi)膜癌細胞系中被鑒定的MMP26，它們的底物是不同的或者是未確定的。
TIMPs是MMP體內(nèi)天然的抑制劑，是一組能抑制MMP活性的多功能因子家族。目前發(fā)現(xiàn)有TIMP1、2、3、4四種，TIMP1、2、4為可溶性蛋白，TIMP3是一種結(jié)合細胞外基質(zhì)的不可溶性蛋白。TIMPs主要是從MMP酶原活化階段、在活化的MMP階段兩個方面抑制MMP的激活。其表達受激素、細胞因子和生長因子多方面的調(diào)控。TIMP通過調(diào)節(jié)MMP的活性調(diào)控細胞外基質(zhì)的更新，細胞外機制合成與降解過程的協(xié)調(diào)依賴于二者間的平衡。子宮內(nèi)膜周期性的增生和剝脫生理過程中無疑貫穿著組織的崩解和重建，因此MMPs和TIMPs的協(xié)調(diào)表達必然在這一過程中起著關(guān)鍵作用。
研究證明組織中MMPs和TIMPs與涉及細胞外基質(zhì)(ECM)降解和重建的生理和病理過程有關(guān)，如子宮內(nèi)膜的周期性增生和脫落、乳腺組織的發(fā)育和萎縮、結(jié)締組織的發(fā)育等。近年來在EMs的研究中也比較關(guān)注MMPs和TIMPs的表達和變化，許多研究表明，MMPs和TIMPs的表達異常與子宮內(nèi)異癥的發(fā)生有一定的關(guān)系，而抑制MMPs活性成為子宮內(nèi)膜異位癥治療的又一新靶點。另外，MMPs近年來的研究還表明MMPs在降解ECM的同時，還具有調(diào)節(jié)細胞生長、凋亡、分化等更廣泛而復雜的生物學作用［2］。另有研究也證明，MMPs和TIMPs在惡性腫瘤細胞的侵潤和轉(zhuǎn)移過程中起著決定性的作用。所以，對異位癥與侵潤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的研究可以增進我們對這種疾病病因的分子機制的理解［3］。
2 MMPs及TIMPs與子宮內(nèi)膜異位癥
子宮內(nèi)膜的月經(jīng)周期變化過程涉及細胞增殖和凋亡、組織降解和重建等一系列細胞行為，有報道表明，在子宮內(nèi)膜不同類型的細胞中，多種MMP分子在子宮內(nèi)膜中的變化與月經(jīng)周期相關(guān)。它們有特異的表達模式，表達水平呈現(xiàn)一定的周期性變化。如Hampton等研究表明，MMP1和MMP3 mRNA的表達嚴格限制在月經(jīng)期。另有研究觀察到MMP7和MMP11不但在月經(jīng)期表達，而且在之后的增殖期也持續(xù)表達，但水平有所下降［4］。除了MMP7在子宮內(nèi)膜上皮細胞特異表達外，子宮內(nèi)膜中的基質(zhì)細胞表達所有類型的MMPs5］。Mizumoto等［6］采用免疫組化研究內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜MMP1、2、3、7、9的表達模式，結(jié)果顯示月經(jīng)期MMP1、2和9在基質(zhì)細胞和上皮細胞，而MMP7僅在上皮細胞都檢測到強烈的表達，并由此推測以為內(nèi)膜對周圍基質(zhì)降解作用是多種MMP共同作用的結(jié)果。MMP3主要表達于某些巨噬細胞，但關(guān)于其表達模式尚不清楚。子宮內(nèi)膜異位癥對胞外基質(zhì)的降解可能涉及多種MMPS，這些MMPs主要產(chǎn)生于基質(zhì)細胞［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)期脫落的內(nèi)膜中.有包括MMP9及TIMP1在內(nèi)的多種MMP及TIMP的表達。目前的研究也逐漸顯示，在EMs患者的病灶組織中一些MMP呈高表達［8］，如異位內(nèi)膜比在位內(nèi)膜產(chǎn)生更多的MMP2，3，9，且MMP3在異位病灶的表達也不具有正常婦女在位內(nèi)膜表達的那種周期性變化，而是呈持續(xù)性高表達［9］。Chung等［10］研究表明與EMs患者在位內(nèi)膜相比，異位內(nèi)膜呈現(xiàn)MMP9，MMP2mRNA高表達和TIMP3、TIMP2低表達。Lim等［11］應(yīng)用免疫組化法對MMP7、9、13在EMs在位和異位內(nèi)膜中的定性表達研究發(fā)現(xiàn):異位內(nèi)膜中MMP7，9，13表達強于在位內(nèi)膜，且在深部內(nèi)異病變中表達強于淺表內(nèi)異病變，故認為MMP由于在異位內(nèi)膜中表達增強使其具有更強的降解細胞外基質(zhì)的能力。最近研究表明，間質(zhì)細胞中的MMP2可能在EMs的進展中起重要作用［12］。由此可見，MMPs在以為病灶中的過度表達已被許多研究證實，同時有效的治療可使其表達水平降低。
此外，研究還發(fā)現(xiàn)一種孕激素受體激動劑——TNPR能有效的下調(diào)MMP在子宮內(nèi)膜中的表達，并且在EMs小鼠模型中有效誘導損傷的減少，從反面證明MMP的表達與EMs的關(guān)系［13］。然而不論從哪個角度去研究，在EMs的發(fā)生過程中MMP的表達均發(fā)生變化，因此設(shè)想MMP在EMs的病理發(fā)生過程中起到一定作用，但具體作用機制尚有待進一步研究。
近年來，隨著研究的不斷深入，對MMPs結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的認識有了迅速增長，同時新的MMPs成員被不斷的發(fā)現(xiàn)。如MMP26 (endometase)是Park等于2000年從子宮內(nèi)膜癌。DNA文庫克隆到的，其分子量僅為28kDa，是目前發(fā)現(xiàn)的MMPs成員中分子量最小的一個。并且MMP26具有與其它MMPs不同的結(jié)構(gòu)特點和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，MMP26在被檢測的8種人組織中，只表達于子宮，提示它可能具備某些特殊的功能。Isaka K等的研究表明MMP26定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞［14］。
TIMPs作為MMPs的組織型抑制劑，可與活性形式的MMPs以1:1的比例形成以非共價鍵和化學鍵結(jié)合的高親和力不可逆的復合物來調(diào)節(jié)MMPs的活性。MMP/TIMP的比例增加與經(jīng)期逆流于腹腔的內(nèi)膜侵襲生長于異位部位有明顯的相關(guān)性。MMP/TTMP失衡導致細胞外基質(zhì)降解，基底膜消失，促使子宮內(nèi)膜在異位部位的生長。TIMP1在間質(zhì)細胞、上皮細胞中表達無明顯差異，且表達于各個時期的內(nèi)膜中。體外動物實驗證實TIMP1可有效地減少異位癥的侵襲生長。Kim等［15］研究發(fā)現(xiàn)TIMP1和TIMP2能抑制血管生成素誘導血管內(nèi)皮細胞出芽。TIMP1可與活化的MMP1、MMP3、MMP9形成復合體而抑制其活性，TIMP2主要抑制MMP2活性，對MMP家族其他成員也有抑制作用，并能阻礙所有被激活的MMPs的水解酶活性。TIMP1/MMP9復合物還能與MMP3結(jié)合形成一個更加穩(wěn)定的三元復合物，導致對MMP3活性的抑制。TIMP3能抑制MMP1、2、3、7、9和13的活性，還能阻斷另外一種金屬蛋白酶ADAM10的活性［16］。TIMP4能抑制MMP2和MMP7的活性，對MMP1、3和9也有較弱的抑制作用，然而TIMP4的研究不夠透徹。Sharpe等對實驗大鼠的研究表明:用GnRHa 治療患子官內(nèi)膜異位癥的大鼠后MMP的活性降低，而MMP抑制物(TIMPs)的活性增加，同時也證實了EMs患者如腹腔中TIMP1明顯下降。且有體外動物實驗證明TIMP1可有效減少異位內(nèi)膜的侵襲生長。
總之，MMPs及TIMPs在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，并為EMs的治療提供了新的靶點。抑制MMPs活性是當前研究的主要方向。在子宮內(nèi)膜異位癥病人中使用簡便易行的、標準化的MMPs， TIMPs檢測，有助于評估病情及治療效果，為廣大EMs患者排憂解難。
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第8篇：蛋白酶抑制劑范文
【摘要】 目的：探討基質(zhì)金屬蛋白酶_7(MMP_7及其組織抑制因子_1(TIMP_1在胃癌中的表達與浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組化檢測36例胃癌標本中腫瘤組織及癌旁組織中MMP_7和TIMP_1的表達，并進行回顧性隨訪。結(jié)果：胃癌組織中MMP_7陽性表達率(58.3%明顯高于癌旁組織(5.6%，P
【關(guān)鍵詞】 胃癌；基質(zhì)金屬蛋白酶_7；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子_1
［Abstract］Objective：To investigate the expression of matrix metalloproteinase_7(MMP_7and tissue inhibitor of metalloproteinase_1(TIMP_1in gastric carcinoma and their relationship with tumor cell invasion and metastasis. Methods：The immunohistochemistry was used to detect the expression of MMP_7 and TIMP_1 in 36 patients with gastric carcinoma. Results: The positive expression rate of MMP_7(58.3%in gastric carcinoma was higher than that of paracarcinoma mucosa(5.6%(P
［Key Words］gastric carcinoma，matrix metalloproteinase_7，tissue inhibitor of metalloproteinase_1
據(jù)統(tǒng)計，約有80%以上的腫瘤病人死于腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，其過程雖很復雜，但其基本步驟包括壓力作用、癌組織粘附性降低、癌細胞遷移、細胞粘附分子作用和細胞外基質(zhì)降解?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP能有效降解細胞外基質(zhì)，在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中均起著重要作用。MMP_7是MMP家族中最小的成員，可降解各種細胞外基質(zhì)成分。為研究胃癌發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機制，本研究應(yīng)用免疫組化檢測胃癌組織中MMP_7和其組織抑制因子_1(TIMP_1的表達，探討其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2004_01—2006_12汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院有完整資料的原發(fā)性胃癌手術(shù)切除標本的存檔蠟塊36例(男性32例，女性4例。年齡44～81歲，平均60.2歲。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，并進行隨訪。病理組織分型：標本經(jīng)病理證實為腺癌，其中低分化腺癌11例，高、中分化腺癌25例。采用國際抗癌聯(lián)盟1987年公布的胃癌TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例。其中有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分別為24和12例。
1.2 檢測方法
手術(shù)標本常規(guī)福爾馬林固定，24h內(nèi)取材，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚4μm，蘇木精_伊紅染色。MMP_7和TIMP_1免疫組化染色。本實驗采用鏈霉素_生物素(S_P免疫組化技術(shù)，MMP_7和TIMP_1單克隆抗體及免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司，中國。按說明書操作。用已知的乳腺癌陽性片作陽性對照，同時用PBS替代一抗作陰性對照。根據(jù)細胞膜或胞漿的染色程度及染色細胞百分率進行判定：細胞膜或胞漿中有棕黃色顆粒沉著為陽性。基本不著色或著色細胞占計數(shù)細胞50%為“+++”。
1.3 統(tǒng)計學處理
各樣本計數(shù)資料采用SPSS10.0軟件包統(tǒng)計處理，組間計數(shù)資料差異比較采用χ2檢驗。
2 結(jié)果
MMP_7在胃癌組織中的陽性表達率(58.3%(21/36顯著高于癌旁組織(5.6%(2/36(P
3 討論
我國胃癌的死亡率一直居惡性腫瘤第一位。胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移是造成胃癌患者死亡的主要原因。胃癌患者的預后與腫瘤的分化、浸潤程度及是否有轉(zhuǎn)移存在著密切相關(guān)性，其中浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學特征，也是影響預后的主要因素。基底膜和細胞外基質(zhì)的降解是惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的首要環(huán)節(jié)。LIOTTA等［6］提出腫瘤侵襲三步(粘附、降解和運動理論。明確肯定了蛋白水解酶在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs是降解細胞外基質(zhì)蛋白的最主要的蛋白水解酶，其活性被體內(nèi)天然存在的TIMPs所抑制，與腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMP_7屬MMPs家族成員，能降解基底膜和細胞外基質(zhì)的多種成分，且是降解基底膜的酶中最重要的一種［2］，在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用。MMP_7可表達于多種組織的病理和生理過程中，但主要表達于某些腫瘤細胞或腫瘤浸潤邊緣的細胞胞漿中。MMP_7對基底膜和基質(zhì)的降解作用有兩面性：①有助于病理損傷和生理生長過程中組織的修復和塑形；②有助于腫瘤細胞的擴散、轉(zhuǎn)移以及腫瘤的血管生長。MMP_7是通過降解細胞外基質(zhì)而促進腫瘤轉(zhuǎn)移的［3］。MMP_7還參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的其它關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如促進腫瘤的血管和淋巴管生成，為腫瘤細胞轉(zhuǎn)移提供門戶等［2］。MMP_7隨胃癌的進展而表達增高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組中陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，表明MMP_7表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，而腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤患者的預后密切相關(guān)，所以MMP_7的檢測有可能成為評價胃癌惡性行為的生物學標記物［4］。彭芳等報道［5］MMP_7的表達水平與浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況和TNM分期密切相關(guān)。MMP_7在淺層浸潤組和深層組的陽性率分別為20.0%和70.0%(P
TIMPs是MMPs的天然抑制劑，它可與活化狀態(tài)的MMPs以1∶1分子比例非共價結(jié)合，這種結(jié)合是不可逆且穩(wěn)定的，從而使MMPs不能發(fā)揮其作用，是MMPs的負調(diào)控因子。MMPs與TIMPs之間的平衡關(guān)系失調(diào)是導致腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要因素，TIMPs通過下調(diào)MMPs的降解活性而抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移［6］。在所有的TIMPs中，TIMP_1作用最強，對于所有類型MMPs均有抑制作用［7］。TIMP_1在胃癌中的表達較少報道，李莉等［8］發(fā)現(xiàn)，TIMP_1與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移和TNM分期呈負相關(guān)。TIMP_1可通過其N端功能區(qū)的半胱氨酸與活化形式MMP_7的鋅離子活性中心結(jié)合，其碳端功能區(qū)與MMP_7的其他部位結(jié)合，以1∶1的比例形成MMP_7－TIMP_1復合體，從而阻斷MMP_7與底物結(jié)合，使MMP_7失去生物學活性，是一種轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)機制［9］。本研究結(jié)果顯示胃癌組織中TIMP_1的陽性表達率為44.4%，癌旁組織50.0%，這可能與我們研究的例數(shù)偏少有關(guān)。但TIMP_1的表達隨胃癌TNM分期增加而減少(P
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第9篇：蛋白酶抑制劑范文
【摘要】 目的： 探討強力霉素（doxycycline，Dox）保護胸腺上皮細胞的作用及其機制，為進一步研究Dox的免疫調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。方法： 利用光學顯微鏡觀察Dox對絲裂霉素(mitomycin， MMC)誘導MTEC1凋亡的影響，同時采用Hochest33342、PI單染、Annexin V和PI雙染確認其作用，最后利用表面加強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分析了SAX2芯片捕獲的Dox作用前后的差異蛋白質(zhì)。結(jié)果： 通過形態(tài)學觀察、Hochest33342、PI單染及Annexin V和PI雙染發(fā)現(xiàn)Dox確實能保護MTEC1抵抗絲裂霉素誘導的細胞凋亡。隨后采用表面加強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分析SAX2芯片捕獲蛋白，發(fā)現(xiàn)Dox能調(diào)控15種蛋白，其中上調(diào)8種，下調(diào)7種。結(jié)論： Dox具有保護MTEC1，抑制MMC誘導的細胞凋亡作用，并對MTEC1的蛋白表達有調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】 強力霉素; 小鼠胸腺髓質(zhì)上皮細胞系; 細胞凋亡； 蛋白質(zhì)芯片
［Abstract］ Objective: To expose the molecular mechanism of doxycycline(Dox) that protects the mouse thymic epithelial cell line(MTEC1) free from apoptosis which induced by mitomycin(MMC).Methods： The effect of Dox protects the MTEC1 cells antiapoptosis against the MMC induced was observed under an optical microscope， and confirmed by Hochest33342 stain， PI single stain， Annexin V and PI double stain， and observed by fluorescence microscope or flow cytometer. Furthermore， SELDI Protein Chip was used to analyze the profile proteomics of MTEC1 cell which treated by doxycycline or not. Results： Dox was found to protect the MTEC1 free from cell apoptosis not only morphology observed with optical microscope but also detected by Hochest33342 stain， PI single stain， Annexin V and PI double stain. Proteomics assay by surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry(SELDITOFMS) disclosed that the Dox can upregulate 8 proteins expressions and downregulate 7 protein expressions. Conclusion： Dox protects MTEC1 against the apoptosis induced by mitomycin and regulated the proteins expressions in MTEC1. It will contribute to the further exploration of the mechanisms of Dox on MTEC1.
［Key words］ doxycycline; mouse thymic epithelial cell line; apoptosis； protein chip
強力霉素（doxycycline，Dox）是屬于半合成的四環(huán)素類抗生素，除具有廣譜抗菌作用外，還具有抗原蟲、螺旋體、衣原體、支原體和立克次體等作用。近年來的研究表明Dox和其他四環(huán)素類抗生素還有其他生物學作用，如①抗腫瘤作用：Dox和四環(huán)素化學修飾物（chemically modified tetracyclines，CMTs） 通過上調(diào)caspase3途徑［1］、Fas/FasL途徑［2］及p53依賴途徑［3］，抑制VEGF［4］、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases2，MMP2），MMP9及VM［5，6］，通過線粒體依賴途徑誘導細胞凋亡［1］，從而殺傷多種腫瘤和抑制腫瘤細胞（前列腺癌、血液系統(tǒng)腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌及其骨轉(zhuǎn)移瘤和骨肉瘤等）的轉(zhuǎn)移；②抗凋亡作用：Dox和米諾霉素（minocycline，Min）可以通過抑制caspase 3，COX2，p38 MAPK和iNOS的表達，在腦缺血發(fā)生時保護腦細胞免于凋亡［7-9］；③抗炎癥作用：Dox和CMTs下調(diào)單核細胞表面的MHCⅡ抗原表達，抑制軟骨細胞、角膜上皮細胞表達炎癥介質(zhì)（IL1，IL6， TNFα和iNOS），抑制IL1轉(zhuǎn)換酶β （IL1 betaconverting enzyme，ICE）的表達；抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎及其軟骨和結(jié)締組織的重塑。在血管損傷中能抑制MMP9和VEGF，從而抑制病理性的血管重塑［10］；④促進細胞增殖：Dox可以刺激纖維細胞、正常淋巴細胞增殖，很少引起多發(fā)性硬化癥患者淋巴細胞增殖和不引起急性播散性腦脊髓炎患者淋巴細胞增殖［11］。⑤免疫調(diào)節(jié)：Dox下調(diào)骨髓來源的樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）其表面標志的共刺激分子CD86，CD80和MHC2Ⅱ；而且在同種異體混合淋巴反應(yīng)中，Dox抑制DCs刺激同種反應(yīng)性T細胞增殖能力［12］。我們在使用TetOn表達系統(tǒng)研究胸腺上皮細胞（thymic epithelial cells， TECs)功能調(diào)節(jié)過程中，意外發(fā)現(xiàn)Dox本身對TECs行為有顯著影響，其能通過活化ERK通路，促進小鼠TECs細胞系（MTEC1）增殖［13］，也促進原代小鼠TECs的增殖，這一結(jié)果提示，Dox可能通過促進TECs增殖的作用，促進T細胞的重建，因此闡明Dox對TECs的作用機制具有重要的意義。本研究采用蛋白質(zhì)組學的方法初步研究了Dox對MTEC1影響，以期尋找相應(yīng)的靶分子，為深入研究Dox的生物學作用機制奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 細胞系 小鼠胸腺髓質(zhì)上皮細胞MTEC1，由北京大學醫(yī)學部免疫學系T細胞研究室建立。
1.1.2 材料和試劑 FITC標記的Annexin V和PI雙染試劑盒：北京寶賽公司產(chǎn)品。Dox，Hochest 33342，PI，已氰，尿素，蛋白酶抑制劑（Leupeptin，Aprotinin和PMSF），Hepes，TriHCl和OGP均購自Sigma公司。注射用絲裂霉素（mitomycin，MMC，日本Kyowa Hakko Kogyo 公司產(chǎn)品）。SAX2蛋白質(zhì)芯片和陰離子交換柱（Hyper Q DF）購于美國Ciphergen公司。蛋白質(zhì)芯片閱讀機由美國Ciphergen公司生產(chǎn)，PBSIIC型。
1.2 方 法
1.2.1 形態(tài)學觀察Dox對MMC誘導的MTEC1細胞凋亡的作用 MTEC1細胞（3×105/孔） 接種于6孔板中，加入Dox（10 μg/ml）培養(yǎng)36 h，然后加入MMC（10 μg/ml）誘導細胞凋亡，同時設(shè)立MMC對照組，培養(yǎng)結(jié)束后于倒置顯微鏡下觀察并照相。
1.2.2 Hochest33342染色檢測細胞凋亡 1×105 MTEC1細胞接種于預先放置無菌小蓋片的6孔板，加入Dox 10 μg/ml培養(yǎng)24 h，然后加入MMC繼續(xù)培養(yǎng)8，18，36，48，60 h，同時設(shè)立空白，MMC和Dox對照，Hochest33342染色觀察。
1.2.3 PI染色 3×105處于對數(shù)生長期的MTEC1細胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入Dox 10 μg/ml培養(yǎng)24 h，然后加入MMC分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h和36 h，同時設(shè)立空白，MMC和Dox對照，PI常規(guī)染色觀察，F(xiàn)ACS分析。
1.2.4 Annexin V和PI雙染 細胞接種同上，加入Dox 10 μg/ml培養(yǎng)24 h，然后加入MMC繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設(shè)立空白，MMC和Dox對照，Annexin V和PI雙染觀察。
1.2.5 細胞總蛋白的提取 MTEC1培養(yǎng)于10%血清的DMEM培養(yǎng)基中。將處于對數(shù)生長期的MTEC1消化，計數(shù)，以1×105/孔接種于6孔板中，當細胞長至70%匯合度時換液，并加入10 μg/ml Dox；對照組采用相同體積的PBS處理細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)72 h，當細胞長成單層后，用細胞刷刮取細胞，冷PBS洗3次，加入細胞裂解液（8 mol Urea，4% CHAPS，40 mmol pH7.4的TrisHCl，1 μg/ml的蛋白酶抑制劑Leupeptin，Aprotinin和0.1 mmol PMSF），靜置30 min，14 000 r/min離心20 min，取上清。用Bandford法測定總蛋白濃度，分裝-80℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.6 水化陰離子交換柱 陰離子交換柱用5倍柱床體積的TrisHCl（50 mol/L，pH9）洗3次，并將上述處理過的柱子儲存在0.8 ml 的緩沖液中，4℃過夜，次日使用。
1.2.7 上樣和洗脫 用1 mol/L尿素調(diào)節(jié)細胞的蛋白濃度至2 mg/ml。取200 μl滴加到陰離子交換柱的柱床上面，1 100 g/min振蕩20 min。
1.2.8 蛋白芯片樣品的制備 陰離子交換柱采用梯度pH洗脫液（pH9，pH7，pH5，pH4）洗脫，以獲得不同pH的流出液組分。每個組分將分別采用SAX2芯片檢測。
1.2.9 SAX2蛋白芯片檢測 將芯片安裝于bioprocessor上，芯片AH點加200 μl 結(jié)合緩沖液（50 mmol Tris+20 mmol NaCl pH 8.0），振蕩室溫下孵育5 min，每點分別加25 μl不同組分流出液和75 μl結(jié)合緩沖液，振蕩孵育60 min，棄掉液體，用200 μl 洗脫緩沖液（50 mmol Tris + 20 mmol NaCl pH 8.0）洗滌芯片2次，每次5 min，加200 μl 1 mmol HEPES（pH7.0）后馬上倒去，卸去bioprocessor，取出芯片各點加兩次0.5 μl SPA，芯片表面干后，用蛋白質(zhì)芯片閱讀機（PBSIIC型）進行蛋白質(zhì)譜分析。
1.2.10 數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析 蛋白質(zhì)芯片采用蛋白質(zhì)芯片閱讀機PBSIIC型讀取數(shù)據(jù)。儀器用標準多肽（peptide all in one）和低于200 kDa的蛋白質(zhì)標準分子（protein all in one） 校正，系統(tǒng)的質(zhì)量偏差為0.1%。檢測芯片時蛋白質(zhì)芯片閱讀機設(shè)置如下：激光強度230、檢測敏感度8，優(yōu)化相對分子質(zhì)量范圍3～50 kDa，最高相對分子質(zhì)量200 kDa，每個樣品收集50個點，采用Ciphergen proteinchip 3.0.2版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù)。兩個蛋白質(zhì)峰比較時，標志蛋白定義為蛋白質(zhì)峰強度相差1倍以上。
2 結(jié) 果
2.1 Dox抑制MMC誘導的MTEC1細胞凋亡的形態(tài)學觀察
我們在以往的研究中發(fā)現(xiàn)Dox能促進MTEC1增殖［13］，而在本次研究中發(fā)現(xiàn)Dox不僅能促進MTEC1增殖，而且能保護其抵抗凋亡（圖1）。
(a)(b)a：Dox （10 μg/ml）實驗組，細胞生長致密，存活良好；b：MMC（10 μg/ml）對照組，細胞大部分死亡，僅有少量存活（100×光鏡下觀察結(jié)果，右上角為200×光鏡下觀察結(jié)果）
2.2 Hochest33342，PI染色和Annexin V＋PI雙染確認Dox的抗凋亡作用
Hochest33342染色的形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)MMC處理MTEC1 36 h能明顯誘導細胞凋亡，而Dox也能明顯地保護MTEC1細胞免于凋亡，同時發(fā)現(xiàn)Dox能明顯促進細胞增殖（圖2）。PI染色發(fā)現(xiàn)在MMC處理36 h后細胞明顯凋亡（42.19%），Dox能保護MTEC1抵抗凋亡，使凋亡細胞下降到15.25%（圖3）。
a～c為Dox處理24 h后MMC誘導MTEC1細胞凋亡24 h；d～f為Dox處理24 h后MMC誘導MTEC1細胞凋亡36 h； a，d：Dox對照組；b，e：MMC處理組；c，f：Dox＋MMC處理組
圖3 經(jīng)PI染色后流式細胞術(shù)分析Dox抑制MTEC1細胞凋亡作用
Fig 3 FCM analyzed the MTEC1 cells that protected by Dox against apoptosis that exposed to MMC with PI staining
Annexin V＋PI雙染觀察發(fā)現(xiàn)MMC誘導24 h后MTEC1早期凋亡細胞占77.74%，而中晚期凋亡細胞占20.12%；加入Dox使MTEC1早期凋亡細胞下降到51.01%，而中晚期凋亡細胞下降到6.30%（圖4）。由此可見，Dox能明顯保護MTEC1抵抗凋亡。
a：圈門設(shè)定；b：正常培養(yǎng)的MTEC1細胞未染色對照；c：正常培養(yǎng)的MTEC1細胞染色對照；d：Dox處理MTEC1細胞24 h；e：MMC誘導MTEC1細胞凋亡24 h；f：Dox處理24 h后MMC誘導MTEC1細胞凋亡24 h
2.3 Dox對MTEC1細胞蛋白表達水平的影響
為了了解Dox促進細胞增殖和保護MTEC1抵抗凋亡的機制，我們采用蛋白芯片技術(shù)對Dox處理前后的MTEC1進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dox作用MTEC1細胞后，SAX2芯片捕獲的蛋白中有15種蛋白發(fā)生表達變化，其中8種蛋白質(zhì)表達增高，有7種蛋白質(zhì)表達降低（表1，圖5）。
表1 強力霉素處理后MTEC1細胞蛋白表達
橫坐標表示相對分子質(zhì)量，縱坐標表示蛋白質(zhì)峰的強度。譜圖從上至下依次為對照細胞和加藥細胞。標記的峰是加藥后表達減弱的蛋白，標記蛋白相對分子質(zhì)量為8 551.2 Da
3 討 論
強力霉素屬于半合成四環(huán)素類藥物，具有廣譜的抗菌、抗原蟲的生物學活性。近年來發(fā)現(xiàn)，其具有廣泛的生物學作用，能誘導腫瘤細胞凋亡、抗炎癥作用、免疫調(diào)節(jié)、促進細胞增殖和保護神經(jīng)細胞抵抗缺血再灌注損傷［1-13］，但是其分子機制尚未完全明確。本項研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)Dox處理的小鼠胸腺上皮細胞具有抵抗MMC誘導的細胞凋亡作用。胸腺上皮細胞在T細胞的發(fā)育、分化和成熟中具有重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)在HIV或移植物抗宿主排斥反應(yīng)中，胸腺上皮細胞經(jīng)常受到嚴重損傷，其作用方式主要是誘導細胞凋亡；而在對老年小鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)，老年鼠的骨髓輸出的T細胞前體細胞的能力是正常的，關(guān)鍵是胸腺上皮細胞發(fā)生了凋亡，因此保護胸腺細胞的藥物及其作用對于胸腺功能的重建具有重要意義。蛋白組學是繼基因組學興起的一門新興學科，通過任何有意義的因素引起的2個樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，可能揭示出細胞生理和病理狀態(tài)的進程、對外界環(huán)境刺激的反應(yīng)途徑，以及細胞調(diào)控機制，同時獲得對某些關(guān)鍵蛋白的定性和功能分析。其中表面加強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry，SELDITOFMS）是蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)，具有快速、操作簡便、樣品用量少和對多樣品的平行檢測等特點。已被廣泛應(yīng)用于腫瘤、免疫性疾病和其他疾病標志物的篩選［14-17］。我們在本試驗中，采用SELDITOFMS分析了由SAX2芯片捕獲的經(jīng)Dox處理的MTEC1和正常培養(yǎng)的MTEC1細胞的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAX2芯片捕獲的蛋白中有15種蛋白發(fā)生表達變化，其中8種蛋白質(zhì)表達增高，7種蛋白質(zhì)表達降低。這些被誘導差異表達的蛋白，為開展進一步的分子機制研究提供了有價值的線索。目前我們正通過與WCX2相匹配的親和柱獲得其中感興趣的蛋白，并進行質(zhì)譜鑒定，從而為闡明絲裂霉素誘導細胞凋亡以及強力霉素抵抗凋亡的作用途徑提供實驗依據(jù)。
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