口腔種植體體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)方法的研究

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【摘要】口腔種植體的體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)主要是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得種植體的生物安全性、骨結(jié)合效能及穩(wěn)定性等相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)，為種植體表面處理改進(jìn)、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)優(yōu)化、縮短負(fù)重時(shí)機(jī)等提供科學(xué)依據(jù)。目前，鮮有報(bào)道，本文對(duì)有關(guān)口腔種植體的體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行綜述。

一、大體觀察

在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行種植手術(shù)前應(yīng)確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無任何不良反應(yīng)或系統(tǒng)性疾病，種植位點(diǎn)近遠(yuǎn)中間隙及頜齦間隙量足，黏膜無明顯紅腫或異常滲出，咬合關(guān)系無明顯異常，無明顯骨壁缺損，盡量統(tǒng)一入組標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)中及時(shí)對(duì)動(dòng)物呼吸、脈搏、心率等生命體征進(jìn)行檢測(cè)，防止動(dòng)物意外死亡。術(shù)后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)定期觀察并記錄種植位點(diǎn)傷口愈合情況、黏膜情況以及種植體有無松動(dòng)脫落等。另外部分學(xué)者用鑷子等金屬器械叩擊種植體，通過聲音及手感對(duì)種植體穩(wěn)定性作出定性評(píng)價(jià)，但此法重復(fù)性差，主觀性強(qiáng)、測(cè)量結(jié)果可靠性較低［3］。

二、牙周健康指標(biāo)評(píng)價(jià)

種植體的牙周健康指標(biāo)能夠反映種植體在口內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性［4］。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，檢查種植體周圍探診深度(probingdepth，PD)，牙齦指數(shù)(gingivalindex，GI)，探診出血指數(shù)(bleedingonprobing，BOP)，改良出血指數(shù)(modifiedsulcusbleedingindex，mSBI)，種植體松動(dòng)度以及邊緣骨吸收程度等指標(biāo)，來反映種植體在動(dòng)物體內(nèi)周圍軟硬組織的生理變化，評(píng)價(jià)新型種植體與對(duì)照植體的優(yōu)缺點(diǎn)。目前種植體失敗的主要原因是種植體周圍炎［5］。以上牙周指標(biāo)能夠?qū)ΨN植體周圍炎的發(fā)生作出客觀定量的評(píng)價(jià)。

三、實(shí)驗(yàn)室檢查

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)文件指出，種植體、修復(fù)用合金等17種應(yīng)用于機(jī)體與生物組織直接接觸的生物醫(yī)用材料需要進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室檢查，為材料的生物安全性提供科學(xué)依據(jù)［6］。動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)室檢查主要在種植手術(shù)前、后2個(gè)階段進(jìn)行，術(shù)前各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)作為對(duì)照組以排除由于動(dòng)物本身全身系統(tǒng)性或代謝性疾病導(dǎo)致的誤差。實(shí)驗(yàn)室檢查的項(xiàng)目主要包括血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)、血?dú)夥治觥⒀娊赓|(zhì)、肝功能、腎功能、血脂、心肌酶、甲狀腺功能、血糖以及血清免疫學(xué)檢測(cè)等。在新型種植體植入前后，比較動(dòng)物各項(xiàng)檢查指標(biāo)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，另外也可以與臨床中已經(jīng)使用的種植體做橫向?qū)Ρ?，討論新型種植體的生物安全性。除以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)外，種植體的體外實(shí)驗(yàn)，包括:溶血實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等因其操作簡(jiǎn)單、靈敏、重復(fù)性好、費(fèi)用低廉可部分代替體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)為確保生物材料安全性，節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，通常應(yīng)先進(jìn)行體外檢測(cè)［7］。近幾年隨著對(duì)種植體周圍炎的研究逐步深入，部分學(xué)者提出齦溝液中的一些細(xì)胞因子是種植體周圍炎的啟動(dòng)因子，例如白介素(interleukin，IL)-17A、IL-35和IL-8等［8］，另外，Niimi等［9］通過臨床試驗(yàn)認(rèn)為種植體周圍齦溝液的量可以反映種植體周圍軟組織的炎癥程度，因此可以監(jiān)測(cè)種植體周圍齦溝液特異性細(xì)胞因子和量的表達(dá)，進(jìn)而反映種植體的炎癥狀態(tài)。

四、影像學(xué)檢查

影像學(xué)檢查能夠在無創(chuàng)條件下，對(duì)種植體的位置、周圍頜骨形態(tài)、骨質(zhì)密度、不同時(shí)點(diǎn)骨吸收程度等進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。根尖片由于其價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、放射劑量小，在種植體的臨床試驗(yàn)中更易被患者接受。但是，由于對(duì)拍攝角度、曝光量和沖洗條件較難統(tǒng)一調(diào)控，導(dǎo)致根尖片檢查的可重復(fù)性較差［10］。另外，與錐形束CT(CBCT)、顯微電子計(jì)算機(jī)斷層攝影(Micro-CT)、核磁共振成像(MRI)相比，根尖片對(duì)種植體周圍骨密度、骨量吸收、骨小梁排列等細(xì)節(jié)成像清晰度較差。CBCT在種植臨床術(shù)前評(píng)估中應(yīng)用廣泛，它能夠清楚的顯示復(fù)雜細(xì)小的解剖結(jié)構(gòu)，如頦管、副頦管和副頦孔、上頜竇壁、血管、顳下頜關(guān)節(jié)、骨小梁、下頜切牙管、舌孔和舌管、根管、牙周組織等［11］。相比傳統(tǒng)多排螺旋CT，CBCT具有放射劑量低、空間分辨率高、全部1∶1成像、影像細(xì)致分明等優(yōu)勢(shì)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CBCT可以定量監(jiān)測(cè)種植體植入后邊緣骨吸收情況，并三維重建種植體在骨內(nèi)位置，合理的評(píng)價(jià)種植體長(zhǎng)期穩(wěn)定性。Micro-CT的辨析率能達(dá)到14μm，相比CBCT對(duì)種植體周圍組織顯像更加細(xì)致［12］。計(jì)算骨-種植體接觸比率曾被認(rèn)為是觀察骨-種植體界面狀態(tài)的最客觀及直接的方法，但缺點(diǎn)是組織切片為二維圖像，所得數(shù)據(jù)不夠準(zhǔn)確。隨著Micro-CT技術(shù)的逐漸成熟，已有一部分學(xué)者開始利用Micro-CT的高分辨率及三維立體成像的優(yōu)勢(shì)，來分析骨-種植體界面，并計(jì)算骨-種植體的三維接觸比率［13］。另外Micro-CT可以對(duì)骨體積、骨密度、骨小梁分離度、骨小梁厚度等進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，便于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。為了獲得精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Micro-CT檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本最好在動(dòng)物處死后，取種植位點(diǎn)局部頜骨標(biāo)本，并用保鮮膜包裹，以免標(biāo)本脫水干燥而影響組織結(jié)構(gòu)觀察［14］。純鈦金屬材料種植體的MRI兼容性已經(jīng)得到大部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)［15］。MRI不僅能夠提供組織精細(xì)的解剖影像，而且能對(duì)軟硬組織中病灶進(jìn)行精確的定位，但純鈦種植體在MRI檢查中，對(duì)其周圍軟組織成像仍有一定偽影，并且偽影面積大小與種植體體積有關(guān)［16］。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中較少使用MRI檢測(cè)種植體周圍軟硬組織變化，通常使用MRI來評(píng)價(jià)新型種植體的體內(nèi)兼容性，檢測(cè)偽影面積對(duì)周圍軟硬組織的影響程度。

五、骨結(jié)合效能檢測(cè)

骨結(jié)合是種植體負(fù)重的基礎(chǔ)，骨結(jié)合效能能夠反映種植體長(zhǎng)期穩(wěn)定性、種植體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是否合理以及種植體表面處理工藝的優(yōu)良。研發(fā)種植體中對(duì)骨結(jié)合的檢測(cè)至關(guān)重要。種植體與骨界面之間的應(yīng)力分為壓應(yīng)力、拉應(yīng)力和剪應(yīng)力，分別用推出實(shí)驗(yàn)、抗拔實(shí)驗(yàn)和扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)［17］。推出實(shí)驗(yàn)是利用萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)將標(biāo)本固定后，沿種植體長(zhǎng)軸方向按一定速率加壓，直至種植體被推出。抗拔試驗(yàn)是根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，用萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)固定骨塊標(biāo)本和種植體修復(fù)基臺(tái)，沿種植體長(zhǎng)軸方向以一定速率加載拉力，記錄即刻拔出作用力。扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)在骨結(jié)合力的檢測(cè)中最為常見，它通常用于螺紋形種植體的生物力學(xué)測(cè)試，而現(xiàn)在大多數(shù)種植體表面均有螺紋［18］。扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)是用萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)固定標(biāo)本和種植體后，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)直至種植體旋出，通過計(jì)算機(jī)記錄每個(gè)種植體的扭矩曲線。在扭矩曲線上可以確定骨-種植體界面破壞時(shí)的屈服點(diǎn)，得出相應(yīng)的臨界扭矩值。Cornelissen等［19］認(rèn)為骨-種植體界面的剛性反映骨結(jié)合的成熟程度。連接牙種植體表面與周圍骨組織發(fā)生直接的生物性鎖結(jié)是保證種植修復(fù)義齒成功的基礎(chǔ)，種植體在植入后，種植體周圍新形成的骨組織逐漸增多并不斷成熟，界面的剛性也逐漸增大。

六、牙周測(cè)試儀檢查

牙周測(cè)試儀能夠測(cè)量種植體骨結(jié)合的穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)具有客觀可重復(fù)性，不會(huì)因操作者不同而出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異［20，21］。但因其測(cè)量耗時(shí)，使用時(shí)需叩擊種植體，對(duì)于種植體植入早期時(shí)會(huì)產(chǎn)生震蕩，影響初期穩(wěn)定性，故無法全程檢測(cè)種植體的骨結(jié)合情況，現(xiàn)已較少使用。

七、組織學(xué)評(píng)價(jià)

種植體研發(fā)中組織學(xué)評(píng)價(jià)的應(yīng)用比較廣泛。帶種植體的骨組織標(biāo)本最好制作為不脫鈣磨片，因其完整的保存了骨組織的礦化結(jié)構(gòu)，標(biāo)本染色后可較為清楚的在種植體周圍顯示新生骨所在區(qū)域，有利于骨形態(tài)參數(shù)的測(cè)量［22］。染色方法一般選擇亞甲基藍(lán)-堿性品紅法、甲苯胺藍(lán)染色法、Coldner’s三色法。不同染色方法顯色情況及優(yōu)缺點(diǎn)如下:①亞甲基藍(lán)-堿性品紅法將成骨細(xì)胞染為深藍(lán)色、類骨質(zhì)為藍(lán)綠色、骨組織為紫色，該染色方法在種植體周圍觀察新生成骨細(xì)胞更加清晰;②甲苯胺藍(lán)染色法將骨組織染為藍(lán)色，將纖維染成白色，該染色方法主要顯示新生骨的成骨情況;③Coldner’s三色法將成骨細(xì)胞染為桔黃色、新生礦化骨為藍(lán)綠色或亮藍(lán)色、成熟骨組織為綠色。在新骨礦化的各個(gè)階段，Coldner’s三色法對(duì)種植體周圍成骨細(xì)胞、類骨質(zhì)、礦化骨均有清晰的顯色。3種顯色方法中，Coldner’s三色法更適合區(qū)分礦化骨和未礦化骨，以及觀察種植體周圍骨礦化各個(gè)階段的形態(tài)學(xué)變化;亞甲基藍(lán)-堿性品紅可用來定量統(tǒng)計(jì)種植體周圍成骨細(xì)胞的情況;甲苯胺藍(lán)染色可以與其他染色方法配合進(jìn)行種植體-骨結(jié)合表面新骨形成面積研究的參照［23，24］。

八、電鏡觀察

電鏡觀察最大的優(yōu)勢(shì)是能夠觀察種植體骨界面的超微結(jié)構(gòu)，成像更加立體、細(xì)致和真實(shí)［25］。不同種類的電鏡觀察方法如下:掃描電鏡分辨率高，除了能夠觀察種植體骨界面超微結(jié)構(gòu)外，還能夠配備X射線能譜儀和X射線波譜儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行定性和無標(biāo)樣定量分析。另外掃描電鏡能夠測(cè)量種植體-骨接觸率及種植體與骨之間的間隙距離。種植體與骨之間的間隙距離通常取同一倍數(shù)下種植體與骨之間的最大間隙、中等間隙和最小間隙，最后取平均值。透射電鏡采用低溫離子減薄制片技術(shù)，用PhlipsEM-430和X射線雙晶衍射儀進(jìn)行觀察分析，界面形成骨組織的標(biāo)志是出現(xiàn)大小不一的高電子密度鈣球或一體化骨鈦復(fù)合體，通過統(tǒng)計(jì)鈣球密度和骨鈦復(fù)合體面積，評(píng)價(jià)種植體骨結(jié)合程度［26］。

九、共振頻率分析

近幾年來，共振頻率(RFA)分析技術(shù)在臨床中用來評(píng)價(jià)種植體穩(wěn)定性，取得了良好的效果［27］。RFA的原理是通過激發(fā)與種植體相連的懸臂梁，通過儀器計(jì)算懸臂梁的共振頻率進(jìn)而代表種植體的穩(wěn)定性，所測(cè)得的種植體穩(wěn)定數(shù)值稱為ISQ值，該值越大，代表種植體的穩(wěn)定性越好［28］。RFA是一種非破壞性的種植體評(píng)價(jià)方法，無需敲擊種植體，且RFA測(cè)量過程不會(huì)影響正常的組織愈合，因此RFA可用于種植體骨整合階段的全程定量監(jiān)測(cè)［29］。

十、口腔黏膜刺激實(shí)驗(yàn)

口腔黏膜刺激實(shí)驗(yàn)是根據(jù)ISO7405-1997國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)的，用來評(píng)價(jià)與口腔黏膜短期或長(zhǎng)期接觸的材料對(duì)黏膜產(chǎn)生的刺激作用，該實(shí)驗(yàn)被國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織列為評(píng)價(jià)口腔材料生物安全性的必需實(shí)驗(yàn)［30］。種植體的生物安全性至關(guān)重要，可將種植體縫合固定在動(dòng)物頰粘膜上，觀察不同時(shí)點(diǎn)黏膜組織代謝情況，為種植體的生物安全性提供科學(xué)依據(jù)。綜上所述，口腔種植體研發(fā)的體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)方法多種多樣。在研究中，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠磉x擇檢測(cè)方法，其中，影像學(xué)檢查和共振頻率分析是檢測(cè)種植體骨結(jié)合過程中比較精確的方法，種植體旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和組織學(xué)評(píng)價(jià)能夠定量反映出種植體骨結(jié)合效能。因此，筆者認(rèn)為以上4種方法在種植體評(píng)價(jià)方法中尤為關(guān)鍵。骨結(jié)合和生物安全性兩個(gè)方面是體內(nèi)評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，如何能夠?qū)崿F(xiàn)在無創(chuàng)條件下，更加直觀、準(zhǔn)確、高效的評(píng)價(jià)種植體的骨結(jié)合程度和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是否優(yōu)良，并將其用于臨床實(shí)踐中仍有待于研究。

作者：王凌霄 高振華 李鈞 單兆臣 單位：首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院種植中心