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摘要:該研究分析了山西老陳醋在傳統(tǒng)工藝發(fā)酵過程中淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶酶活變化,并對發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉、總糖、酒精度、總酸、有機酸和氨基酸等常規(guī)成分的變化規(guī)律與形成機理進行了探討。結(jié)果表明,酒精發(fā)酵階段,4種酶活力變化不大,醋酸發(fā)酵階段,4種酶活力均有所降低;發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉含量由64.05%降至18.88%;酒精發(fā)酵階段,總糖含量從11.88%降至1.12%,醋酸發(fā)酵階段,總糖含量從2.28%增至7.35%,熏蒸階段,總糖含量從7.13%降至5.89%;酒精含量在酒精發(fā)酵過程中從1.3%vol增至5.7%vol,到發(fā)酵22d時幾乎降為0;總酸含量在1~22d內(nèi)從1.17%增至10.23%;在發(fā)酵及熏蒸過程中醋酸含量從1.03mg/g增至76.25mg/g;酒精發(fā)酵階段,乳酸含量從1.94mg/g增至60.60mg/g,隨后含量變化較小。
關(guān)鍵詞:山西老陳醋;傳統(tǒng)工藝;常規(guī)成分;分析
山西老陳醋是我國傳統(tǒng)的四大名醋之一,其獨特生產(chǎn)工藝的確立已有300多年的歷史,被列為國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn),產(chǎn)品具有有機酸組成豐富、氨基酸含量高、品質(zhì)和風味優(yōu)良等特點[1]。山西老陳醋的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝,以高粱、麩皮為主要原料,以谷糠為輔料,以大麥、豌豆為原料制作的大曲作為糖化發(fā)酵劑,高粱、大曲、麩皮和谷糠的比例為100:62.5:70:100,生產(chǎn)工藝包括原料處理、拌曲、(糖化)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、熏蒸(醋醅)、淋醋、陳釀等步驟[1]。整個生產(chǎn)過程,除淋醋和陳釀階段外,歷經(jīng)31d,其中1~16d為酒精發(fā)酵,17~25d為醋酸發(fā)酵,26~31d為熏蒸。其中熏蒸是傳統(tǒng)山西老陳醋生產(chǎn)中一道特有的工序,在這一過程中醋醅由黃色變?yōu)樯詈稚?,能增加醋的色澤和焦香味,對傳統(tǒng)山西老陳醋色、香、味的形成具有重要的作用關(guān)于食醋生產(chǎn)過程中常規(guī)成分的變化分析已有很多報道[3-9]。但對山西老陳醋在發(fā)酵及熏蒸過程中常規(guī)成分的變化研究報道很少。本研究分析了山西老陳醋在發(fā)酵及熏蒸過程中糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等酶活變化,并對發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉、總糖、還原糖、酒精度、總酸、有機酸和氨基酸態(tài)氮等成分變化規(guī)律與形成機理進行了分析。研究結(jié)果對山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的改良具有指導意義。
1材料與方法
1.1材料與試劑
實驗樣品均取自山西老陳醋集團有限公司傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)車間。在發(fā)酵的第1、3、5、8、11、14、16天(酒精發(fā)酵)采集酒醪樣品;第17天、19~25天(醋酸發(fā)酵)采集醋醅樣品;第27~31天(熏蒸階段)采集熏醅樣品。NaOH、甲醇、冰醋酸、CHCl3、乙酸乙酯(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;乙酸、乳酸、檸檬酸(均為優(yōu)級純):美國Sigma公司;蒽酮(分析純):上海試劑一廠。
1.2儀器與設(shè)備
Z-5000型原子吸收分光光度計:日本日立株式會社;AF-610B型原子熒光分光光度計:北京瑞麗儀器有限公司;L-8000型全自動氨基酸分析儀:上海滬西分析儀器廠有限公司;Waters2695型高效液相色譜儀:美國Waters公司;HC-2062型高速離心機:安徽中科中佳科學儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1淀粉酶、糖化酶和蛋白酶活力的測定
淀粉酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dini-trosalicylicacid,DNS)比色法[10],以1g物料在40℃,pH5.6的條件下,每1min水解得到的還原糖的量為一個總淀粉酶活力單位(U/g)。糖化酶活力的測定參照GB8276—2006《食品添加劑糖化酶制劑》的方法進行[11],并略有改動,以1g物料在40℃,pH4.6的條件下,每1h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為一個糖化酶活力單位(U/g)。蛋白酶活力的測定參照國標GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林比色法[12],以1g物料在40℃,pH3.0或pH7.2,每1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸,定義為一個酸性或中性蛋白酶活力單位(U/g)。
1.3.2理化指標的測定
水分含量的測定參照GB5009.3—2010《食品中水分的測定》中的105℃恒質(zhì)量法[13];淀粉含量的測定參照GB/T5514—2008《糧食、油料中淀粉含量測定》中酶水解法[14];蛋白質(zhì)含量的測定參照GB5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的自動凱氏定氮儀法[15];脂肪含量的測定參照GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法[16];總糖的測定采用蒽酮比色法[17];還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮的測定分別參照GB/T5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的菲林試劑法[18]、GB/T5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》中的酸堿滴定法[19]和GB/T5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》的甲醛滴定法[20]進行;酒精度的測定采用酒精計法。
1.3.3游離氨基酸的測定
游離氨基酸的測定參照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》的方法進行[21]。酒醪、醋醅和熏醅樣品經(jīng)蒸餾水浸提后,過濾得到的溶液定容至250mL,作為待測液。取1mL待測液用6mol/L的HCl稀釋一倍,過0.45μm濾膜后,用于氨基酸自動分析儀測定樣品中的氨基酸含量。
1.3.4有機酸的分析
有機酸的測定采用GB/T5009.157—2003《食品中有機酸的測定》中的高效液相色譜法[22]。色譜條件:SpursilC18-EP色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:20mmol/L的KH2PO4溶液(pH2.5);流速:1mL/min;柱溫:30℃;進樣量:10μL;檢測器:紫外檢測器,檢測波長210nm。
2結(jié)果與分析
2.1發(fā)酵階段淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的活力變化
淀粉酶、糖化酶和蛋白酶是參與谷物食醋釀造的主要酶類,本實驗對酒精和醋酸發(fā)酵過程中這幾種酶的活力進行了檢測,山西老陳醋在傳統(tǒng)工藝的酒精發(fā)酵(1~16d)與醋酸發(fā)酵(17~25d)過程中,淀粉酶和糖化酶的活力較高,最高分別為438.94U/g和257.23U/g,而酸性和中性蛋白酶活力較低,分別只有64.56U/g和27.40U/g。4種酶活在酒精和醋酸發(fā)酵階段略有變化但基本穩(wěn)定,且酒精發(fā)酵階段的酶活明顯高于醋酸發(fā)酵階段,這與醋酸發(fā)酵階段加入了麩皮和谷糠的稀釋作用有關(guān),也可能與此階段大量產(chǎn)生醋酸有關(guān)。
2.2發(fā)酵及熏蒸過程中的變化
對傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中水分、淀粉、總糖、還原糖、酒精度、總酸、氨基態(tài)氮等的變化進行了分析,在醋酸發(fā)酵階段(17~25d),水分含量穩(wěn)定在62%~63%,淀粉由35.10%下降至27.48%(干質(zhì)量),總糖含量從2.28%增加至7.35%,還原糖含量從4.70%增加至8.54%,總酸在第22天達到最高,為10.23%。在此階段,淀粉酶和糖化酶仍有一定活力(圖1),可將淀粉繼續(xù)水解為糖,但醋酸菌是該階段的優(yōu)勢菌種,它能迅速氧化酒精生成乙酸,并降低pH值,抑制其它微生物生長,因此糖類物質(zhì)被利用較少,含量均略有增加。酒精在醋酸菌作用下迅速轉(zhuǎn)化為醋酸,至第22天已檢測不到;對應地總酸含量在第22天達到最高不再增加。由于醋酸發(fā)酵階段蛋白酶的活力很低(圖1),所以蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量變化很小。熏蒸(27~31d)是一個加熱的過程,水分由于蒸發(fā)作用而明顯降低(64.2%~57.2%);淀粉由于加熱和有機酸存在,由27.65%下降至18.88%(干質(zhì)量);因美拉德反應,還原糖和氨基酸含量分別由7.75%和0.41%下降至2.91%和0.28%;總糖略有減少,脂肪和蛋白質(zhì)含量基本不變,總酸含量增加,但不明顯。
2.3發(fā)酵及熏蒸過程中氨基酸的變化在傳統(tǒng)山西老陳醋的在酒精與醋酸發(fā)酵
以及熏蒸過程中能檢測到至少20種氨基酸,包括人體必需的8種氨基酸,各種氨基酸含量的變化趨勢大致可以歸納為:酒精發(fā)酵過程中有不同程度的增加,醋酸發(fā)酵過程中變化不大,熏蒸階段有不同程度的降低。結(jié)合圖1的結(jié)果,在酒精發(fā)酵階段氨基酸的增加主要是蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的,所以除賴氨酸、組氨酸和鳥氨酸外,其他氨基酸含量均有所增加。而賴氨酸、組氨酸和鳥氨酸含量減少,主要是這些氨基酸在高粱等谷物蛋白中總量較少[24],同時參與微生物(如酵母菌)菌體生長代謝所致。在醋酸發(fā)酵過程中,蛋白酶活力降低,而氨基酸仍需參與微生物(如醋酸菌)菌體的生長代謝,因此,含量較高的氨基酸變化較小,含量較低的氨基酸(如賴氨酸)顯著降低。在熏蒸過程中,由于氨基酸和還原糖的美拉德反應,因此,各種氨基酸的含量均有所降低。
2.4發(fā)酵及熏蒸過程中有機酸的變化分析
酸味物質(zhì)是食醋中的主要組成成分,有機酸是酸味的主要來源,其種類、含量及其相互比例與食醋的質(zhì)量密切相關(guān)[25]。本實驗采用師晶晶[5]建立的山西老陳醋中有機酸的分析方法,對傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中醋酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丙酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸進行了測定,醋酸和乳酸是傳統(tǒng)山西老陳醋生產(chǎn)過程中含量變化最大的兩種有機酸。在酒精發(fā)酵過程中,乳酸是主要的有機酸,醋酸含量在酒精發(fā)酵初期也有所增加。醋酸發(fā)酵前期,醋酸含量增加明顯,后期(22~25d)基本保持不變,從工藝改良的角度出發(fā),醋酸發(fā)酵的時間可縮短到第22天,總發(fā)酵時間可縮短4d。由于酒精發(fā)酵的4~16d主要是厭氧發(fā)酵,因此乳酸菌能產(chǎn)生大量乳酸。這與吳佳佳[23]從山西老陳醋的發(fā)酵酒醪中分離到了很多乳酸菌,并隨著酒精發(fā)酵時間延長,乳酸菌的種類增多的結(jié)果相吻合。在醋酸發(fā)酵階段,由于麩皮、谷糠添加的稀釋作用,在初期(17d)醋酸和乳酸含量迅速降低,但由于醋酸菌的接入和通氣量的增加,酒精轉(zhuǎn)化成醋酸,使醋酸的含量快速上升,成為最主要的有機酸。而在熏蒸階段醋酸和乳酸的含量均略有升高。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸,在整個生產(chǎn)過程中,基本呈現(xiàn)先升高,后降低,再升高的趨勢。在醋酸發(fā)酵和熏蒸過程中,酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸的含量增加,這可能與微生物的發(fā)酵和熏蒸過程中水分的蒸發(fā)有關(guān)。丙酸在第3天時含量達到10.47mg/g,隨后降低;第17天向酒醪中添加麩皮和谷糠,丙酸含量明顯升高,這可能是因為填充料帶入了一部分丙酸造成的;但第19天其含量突然降低,具體原因仍需進一步探討,在熏蒸過程中,丙酸的含量降低。
3結(jié)論
酒精發(fā)酵階段,淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶的活力雖然呈現(xiàn)出高-低-高的趨勢,但基本穩(wěn)定。在山西老陳醋的傳統(tǒng)工藝中,曲的用量非常大(高粱與大曲質(zhì)量比為100∶62.5),大曲除了是微生物(霉菌、酵母菌、醋酸菌等)的載體外,也是酶制劑,曲中淀粉酶等水解酶迅速分解淀粉變成糖,總糖和還原糖也在酒精發(fā)酵階段的第1天最高。所以酒精發(fā)酵階段的水解酶主要來自大曲,后期酶活稍有升高,可能是霉菌等微生物生長產(chǎn)生的。在醋酸發(fā)酵階段,由于添加了麩皮和谷糠,酒醪被稀釋,同時醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸,pH降低,酶活受到抑制,因此,各水解酶的活力均有所降低。由于酵母等微生物生長代謝,總糖、還原糖含量在酒精發(fā)酵階段不斷降低;而在醋酸發(fā)酵階段略有增加的原因,可能是在此階段糖化酶和淀粉酶仍具有一定的活性,可繼續(xù)水解淀粉產(chǎn)生寡糖和單糖,而醋酸菌等微生物較少利用它們;在熏蒸階段又降低,由于還原糖和氨基酸在加熱的情況下,易發(fā)生美拉德反應,消耗了糖類。酒精含量在酒精發(fā)酵的第1~11天上升,在酒精發(fā)酵后期(14~16d)保持穩(wěn)定,在醋酸發(fā)酵第4天時檢測不出,酒精發(fā)酵的時間可縮短2d??偹岷繌牡?~22天增加,而從第23~31天其含量變化不明顯。氨基酸在酒精發(fā)酵過程中含量明顯增加,此階段蛋白酶的活力較強,能分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸;氨基酸含量在醋酸發(fā)酵過程中變化較小,此階段蛋白酶活力顯著降低,能少量分解蛋白質(zhì)生成氨基酸;熏蒸過程中氨基酸含量有不同程度的降低,由于氨基酸和還原糖在加熱的條件下易發(fā)生美拉德反應,消耗了氨基酸。醋酸是山西老陳醋中的主要成分,在醋酸發(fā)酵前期和熏蒸過程中含量明顯增加,在醋酸發(fā)酵后期(22~25d)基本保持不變,醋酸發(fā)酵的時間可縮短到第22天,總發(fā)酵時間可縮短6d。乳酸主要在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生,在醋酸發(fā)酵和熏蒸過程中變化較小。其他有機酸在發(fā)酵及熏蒸過程中含量較低,變化較小。
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作者:陳濤 桂青 郭俊陸 王正剛 陳福生 單位:華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所 山西老陳醋集團有限公司 環(huán)境食品學教育部重點實驗室