生物質(zhì)譜技術(shù)與方法精選(九篇)

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第1篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)，質(zhì)譜分析，應(yīng)用

前言：

蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細(xì)胞，約占細(xì)胞干質(zhì)量的50%以上，作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來(lái)物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用，因此蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對(duì)象。關(guān)于蛋白質(zhì)的分析研究，一直是化學(xué)家及生物學(xué)家極為關(guān)注的問(wèn)題，其研究的內(nèi)容主要包括分子量測(cè)定，氨基酸鑒定，蛋白質(zhì)序列分析及立體化學(xué)分析等。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，儀器分析手段的更新，尤其是質(zhì)譜分析技術(shù)的不斷成熟，使這一領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速。

自約翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)發(fā)明了對(duì)生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的方法及發(fā)明了對(duì)生物大分子的質(zhì)譜分析法以來(lái)，隨著生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物質(zhì)譜目前已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之一[1]。它的發(fā)展強(qiáng)有力地推動(dòng)了人類(lèi)基因組計(jì)劃及其后基因組計(jì)劃的提前完成和有力實(shí)施。質(zhì)譜法已成為研究生物大分子特別是蛋白質(zhì)研究的主要支撐技術(shù)之一，在對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究中占據(jù)了重要地位[2]。

1．質(zhì)譜分析的特點(diǎn)

質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn)：很高的靈敏度能為亞微克級(jí)試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測(cè)定，同時(shí)具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性。

2．質(zhì)譜分析的方法

近年來(lái)涌現(xiàn)出較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：1)電噴霧電離質(zhì)譜；2)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜；3)快原子轟擊質(zhì)譜；4)離子噴霧電離質(zhì)譜；5)大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技術(shù)中，以前面三種近年來(lái)研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛[3]。

3．蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復(fù)雜結(jié)構(gòu)主要包括以肽鏈為基礎(chǔ)的肽鏈線型序列[稱(chēng)為一級(jí)結(jié)構(gòu)]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱(chēng)為二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)]結(jié)構(gòu)。目前質(zhì)譜主要測(cè)定蛋自質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。

3.1蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理

以往質(zhì)譜(MS)僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)始用于生物大分子的分析。其原理是：通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。

3.2蛋白質(zhì)和肽的序列分析

現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的小肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫(kù)是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測(cè)定方法支持這些研究的進(jìn)行。現(xiàn)有的肽和蛋白質(zhì)測(cè)序方法包括N末端序列測(cè)定的化學(xué)方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱(chēng)PTH法)，測(cè)序速度較慢(50個(gè)氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nmol級(jí)或幾十pmol級(jí))；對(duì)樣品純度要求很高；對(duì)于修飾氨基酸殘基往往會(huì)錯(cuò)誤識(shí)別，而對(duì)N末端保護(hù)的肽鏈則無(wú)法測(cè)序[4]。C末端化學(xué)降解測(cè)序法則由于無(wú)法找到PITC這樣理想的化學(xué)探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛注意。在質(zhì)譜測(cè)序中，靈敏度及準(zhǔn)確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對(duì)象進(jìn)行的。近年來(lái)隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測(cè)限下降到fmol級(jí)別，可測(cè)定分子量范圍則高達(dá)100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDITOFMS)已成為測(cè)定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)的有效工具，也是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中重大課題——蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一[5]。目前在歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室(EMBL)及美國(guó)、瑞士等國(guó)的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)(序列)譜庫(kù)，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結(jié)果提供可靠的依據(jù)[6]。

3.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式

質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測(cè)定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測(cè)各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索與之相對(duì)應(yīng)的已知蛋白，從而獲取待測(cè)蛋白序列。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”是一重要測(cè)列方法。第二種方法是利用待測(cè)分子在電離及飛行過(guò)程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過(guò)分析相鄰?fù)M類(lèi)型峰的質(zhì)量差，識(shí)別相應(yīng)的氨基酸殘基，其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測(cè)序(laddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基。

3.3.1蛋白消化

蛋白的基團(tuán)越大，質(zhì)譜檢測(cè)的準(zhǔn)確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測(cè)之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測(cè)的準(zhǔn)確率。一般而言，6-20個(gè)氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測(cè)?，F(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴(lài)氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會(huì)產(chǎn)生相同的多肽。

3.3.2基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量法(MALDI-TOFMS)[7]

簡(jiǎn)而言之，基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量?jī)x是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號(hào)，并依據(jù)質(zhì)量/電荷之比(mass/charge，m/z)來(lái)對(duì)該多肽進(jìn)行分析，以判斷該多肽源自哪一個(gè)蛋白。待檢樣品與含有在特定波長(zhǎng)下吸光的發(fā)光團(tuán)的化學(xué)基質(zhì)(matrix)混合，此樣品混合物隨即滴于一平板或載玻片上進(jìn)行揮發(fā)，樣品混合物殘余水份和溶劑的揮發(fā)使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子發(fā)生器(lasersource)。激光作用于樣品混合物，使化學(xué)基質(zhì)吸收光子而被激活。此激活產(chǎn)生的能量作用于多肽，使之由固態(tài)樣品混合物變成氣態(tài)。由于多肽分子傾向于吸收單一光子，故多肽離子帶單一電荷.這些形成的多肽離子直接進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀(TOFmassanalyzer)。飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀用于測(cè)量多肽離子由分析儀的一端飛抵另一端探測(cè)器所需要的時(shí)間。而此飛行時(shí)間同多肽離子的質(zhì)量/電荷的比值成反比，即質(zhì)量/電荷之比越高，飛行時(shí)間越短。最后，由電腦軟件將探測(cè)器錄得的多肽質(zhì)量/電荷比值同數(shù)據(jù)庫(kù)中不同蛋白經(jīng)蛋白酶消化后所形成的特定多肽的質(zhì)量/電荷比值進(jìn)行比較，以鑒定該多肽源自何種蛋白.此法稱(chēng)為多肽質(zhì)量指紋分析(peptidemassfin-gerprinting)。基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量法操作簡(jiǎn)便，敏感度高，同許多蛋白分離方法相匹配，而且，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中有充足的關(guān)于多肽質(zhì)量/電荷比值的數(shù)據(jù)，因此成為許多實(shí)驗(yàn)室的首選蛋白質(zhì)譜鑒定方法。

3.3.3電子噴霧電離質(zhì)譜測(cè)量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8]

同基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量法在固態(tài)下完成不同，電子噴霧電離質(zhì)譜測(cè)量法是在液態(tài)下完成，而且多肽離子帶有多個(gè)電荷，由高效液相層析等方法分離的液體多肽混合物，在高壓下經(jīng)過(guò)一細(xì)針孔。當(dāng)樣本由針孔射出時(shí)，噴射成霧狀的細(xì)小液滴，這些細(xì)小液滴包含多肽離子及水份等其他雜質(zhì)成分。去除這些雜質(zhì)成分后，多肽離子進(jìn)入連續(xù)質(zhì)量分析儀(tan-demmassanalyzer)，連續(xù)質(zhì)量分析儀選取某一特定質(zhì)量/電荷比值的多肽離子，并以碰撞解離的方式將多肽離子碎裂成不同電離或非電離片段。隨后，依質(zhì)量/電荷比值對(duì)電離片段進(jìn)行分析并匯集成離子譜(ionspectrum)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，由這些離子譜得到該多肽的氨基酸序列。依據(jù)氨基酸序列進(jìn)行的蛋白鑒定較依據(jù)多肽質(zhì)量指紋進(jìn)行的蛋白鑒定更準(zhǔn)確、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通過(guò)蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，也可通過(guò)核糖核酸數(shù)據(jù)庫(kù)檢索來(lái)進(jìn)行蛋白鑒定。

4．蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的應(yīng)用

1981年首先采用FAB雙聚焦質(zhì)譜測(cè)定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子[M+1]+=1319強(qiáng)峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白質(zhì)合適用FAB質(zhì)譜分析，更大分子量的多肽和蛋自質(zhì)可用MALDI質(zhì)譜或ESI質(zhì)譜分析。用MALDI-TOF質(zhì)譜分析蛋自質(zhì)最早一例是HillenKramp等[9]于1988年提出用紫外激光以煙酸為基質(zhì)在TOF譜儀上測(cè)出質(zhì)量數(shù)高達(dá)60kDa蛋白質(zhì)，精確度開(kāi)始只有0.5%，后改進(jìn)到0.1-0.2%。質(zhì)譜技術(shù)主要用于檢測(cè)雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量，也可用于蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互作用等方面的研究[10,11],三條肽段的精確質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì)。近年來(lái)，串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛，其數(shù)據(jù)采集方面的自動(dòng)化程度、檢測(cè)的敏感性及效率都大大提高，大規(guī)模數(shù)據(jù)庫(kù)和一些分析軟件(如:SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進(jìn)行更大規(guī)模的測(cè)序工作。目前，利用2D電泳及MS技術(shù)對(duì)整個(gè)酵母細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析，已經(jīng)鑒定出1484種蛋白質(zhì)，包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì)[12]；分析肝細(xì)胞癌患者血清蛋白質(zhì)組成分[13]，并利用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用質(zhì)譜技術(shù)研究許旺細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白(SDNP)的分子結(jié)構(gòu)[15]等。

結(jié)束語(yǔ)：

在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析中，質(zhì)譜的準(zhǔn)確性(accuracy)對(duì)測(cè)定結(jié)果有很大影響，因此質(zhì)譜測(cè)序現(xiàn)在仍很難被應(yīng)用于未知蛋白的序列測(cè)定。肽和蛋白的質(zhì)譜序列測(cè)定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點(diǎn)，這些都非常適合于現(xiàn)在科學(xué)研究的需要。我們相信，隨著各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進(jìn)，蛋白雙向電泳的應(yīng)用[16]以及質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善，質(zhì)譜將會(huì)成為多肽和蛋白質(zhì)分析最有威力的工具之一。

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第2篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

【摘要】 脂質(zhì)的生物功能具有多樣性，其代謝與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。脂質(zhì)的分析量化對(duì)研究疾病發(fā)生機(jī)理和診斷治療，以及醫(yī)藥研發(fā)有非常重要的生物學(xué)意義。分析技術(shù)的快速發(fā)展，特別是質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)的運(yùn)用，促使脂質(zhì)分析不斷完善。脂組學(xué)就是對(duì)生物樣本中脂質(zhì)的整體分析，是代謝組學(xué)的重要組成部分，能夠促進(jìn)代謝組學(xué)的發(fā)展。本文就脂質(zhì)的生物功能、脂質(zhì)分析以及脂組學(xué)的研究現(xiàn)狀作簡(jiǎn)要評(píng)述。

【關(guān)鍵詞】 脂組學(xué)，脂質(zhì)分析，電噴霧離子化質(zhì)譜，代謝組學(xué)，評(píng)述

1 引 言

脂類(lèi)物質(zhì)是生物體的能量提供者，參與了大量的生命活動(dòng)，具有非常重要的生理功能。脂質(zhì)分子在與其它化合物的相互作用，構(gòu)成了復(fù)雜的代謝過(guò)程，對(duì)生物體疾病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響。據(jù)報(bào)道，很多疾病都與脂代謝紊亂有關(guān)，如：糖尿病、肥胖病、老年癡呆癥、癌癥等[1～6]。因此，生命體中脂類(lèi)物質(zhì)及其代謝過(guò)程的研究成為疾病發(fā)病機(jī)理和診斷治療以及醫(yī)藥研發(fā)過(guò)程的重點(diǎn)。為了得到生物樣本中更為全面的脂質(zhì)信息，更好地反映生物體內(nèi)脂類(lèi)物質(zhì)的作用機(jī)制，并能找到與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物或代謝規(guī)律，為疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)，科學(xué)家已經(jīng)將脂質(zhì)的整體分析做為了研究的重點(diǎn)。

隨著生命分析化學(xué)的發(fā)展，電噴霧離子化質(zhì)譜(ESIMS)成功地運(yùn)用到脂質(zhì)的分析，特別是色譜質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，為脂質(zhì)的整體分析提供了技術(shù)支持，也加速了脂組學(xué)的誕生。2003年，Han等[7]正式提出了脂組學(xué)(Lipidomics) 的概念，即對(duì)生物樣本中脂質(zhì)進(jìn)行全面的系統(tǒng)分析，并以此為依據(jù)推測(cè)其它與脂質(zhì)作用的生物分子的變化，進(jìn)而揭示脂質(zhì)在各種生命現(xiàn)象中的重要作用機(jī)制。上世紀(jì)90年代興起的代謝組學(xué)，是以分析生命體中的所有小分子代謝物為研究?jī)?nèi)容的。對(duì)脂質(zhì)及其代謝物進(jìn)行整體分析的脂組學(xué)，則可以看作是代謝組學(xué)的一個(gè)分支，并能夠在一定程度上促進(jìn)代謝組學(xué)的發(fā)展。

目前，脂組學(xué)已經(jīng)受到越來(lái)越多科研機(jī)構(gòu)的關(guān)注[8]，其中以美國(guó)的研究機(jī)構(gòu)最為著名：美國(guó)國(guó)立綜合醫(yī)學(xué)研究所(National lnstitute of general medical sciences， NIGMS)、由王學(xué)敏教授領(lǐng)導(dǎo)組建的堪薩斯州立大學(xué)脂組學(xué)研究中心(Kansas lipdomics research center，KLRC) 和華盛頓大學(xué)的ORY課題組;歐洲和亞洲也同樣出現(xiàn)了脂組學(xué)的研究機(jī)構(gòu)：格拉茨大學(xué)、奧地利科學(xué)院及格拉茨技術(shù)大學(xué)等共同成立了格拉茨脂組學(xué)研究中心(Lipidomics research center graz，LRCGraz);新加坡國(guó)立大學(xué)Wenk教授也成立了Lipid Profile課題組。此外，還有很多課題組致力于脂組學(xué)與代謝組學(xué)的研究。

可見(jiàn)，脂組學(xué)的研究已經(jīng)成為眾多科研機(jī)構(gòu)研究的熱點(diǎn)。本文就脂組學(xué)的研究現(xiàn)狀作簡(jiǎn)要評(píng)述，并通過(guò)了解脂組學(xué)與代謝組學(xué)等其它組學(xué)的關(guān)系，對(duì)脂組學(xué)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

2 脂的分類(lèi)與生物功能

脂質(zhì)在化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)上有很大差異，但都有一個(gè)共同特性，即：不溶于水而易溶于乙醚、氯仿等非極性溶劑。脂質(zhì)通常分為真脂和類(lèi)脂兩大類(lèi) (如圖解1所示)。脂質(zhì)是組成生物體的重要成分，如磷脂是構(gòu)成生物膜的重要組分，油脂是機(jī)體代謝所需燃料的貯存和運(yùn)輸載體。脂類(lèi)物質(zhì)也可為動(dòng)物機(jī)體提供必需的脂肪酸和脂溶性維生素。某些萜類(lèi)及類(lèi)固醇類(lèi)物質(zhì)如維生素A，D，E，K，膽酸及類(lèi)固醇激素具有營(yíng)養(yǎng)、代謝及調(diào)節(jié)功能。有機(jī)體表面的脂類(lèi)物質(zhì)有防止機(jī)械損傷與熱量散發(fā)等保護(hù)作用。脂類(lèi)作為細(xì)胞的表面物質(zhì)，與細(xì)胞識(shí)別、種特異性和組織免疫等有密切關(guān)系。對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)應(yīng)充分了解其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從而確定樣本分析的色譜分離條件和質(zhì)譜條件。

3 脂組學(xué)及其研究現(xiàn)狀

3.1 脂組學(xué)的研究?jī)?nèi)容及特點(diǎn)

脂組學(xué)的研究?jī)?nèi)容為生物體內(nèi)的所有脂質(zhì)分子，并以此為依據(jù)推測(cè)與脂質(zhì)作用的生物分子的變化，揭示脂質(zhì)在各種生命活動(dòng)中的重要作用機(jī)制[7～10]。通過(guò)研究脂質(zhì)提取物， 可獲得脂質(zhì)組 (Lipidome)的信息，了解在特定生理狀態(tài)下脂質(zhì)的整體變化。脂組學(xué)是代謝組學(xué)不可或缺的一部分。脂組學(xué)的研究有以下優(yōu)勢(shì)：只研究脂質(zhì)物質(zhì)及其代謝物，脂質(zhì)物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的共同點(diǎn)決定了樣品前處理及分析技術(shù)平臺(tái)的搭建較為容易，而且可以借鑒代謝組學(xué)的研究方法;脂組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和完善速度較快，并能建立與其它組學(xué)的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系;脂質(zhì)組分析的技術(shù)平臺(tái)可用于代謝組學(xué)的研究，促進(jìn)代謝組學(xué)發(fā)展。

3.2 脂組學(xué)的研究方法

3.2.1 樣品制備 脂質(zhì)主要從細(xì)胞、血漿、組織等樣品中提取。由于脂質(zhì)物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上有共同特點(diǎn)，即有極性的頭部和非極性的尾部。所以，脂質(zhì)采用了氯仿和甲醇的混合提取液，能夠更好地溶出樣本中的脂質(zhì)物質(zhì)。Yoo 等[11]將 3 mL的氯仿/甲醇 (1∶2， V/V) 加入 4 mL的細(xì)胞懸浮液，然后加入 0.8 mL水，超聲 0.5 min，再加入 1 mL氯仿和 1 mL水后 2000×g 離心 5 min，室溫靜置 30 min，取氯仿層，氮?dú)獯蹈?，進(jìn)樣前采用流動(dòng)相溶解干物待用。這種脂質(zhì)提取方法，能夠提出血漿、腦組織樣品中的總脂[1， 12]。Matyash 等[13]用甲基叔丁酰乙醚(methyltertbutyl ether， MTBE)提取樣品中的脂質(zhì)物質(zhì)。這種方法簡(jiǎn)化了富集過(guò)程，降低了損失率，不溶于MTBE的雜質(zhì)在容器底部形成小球，容易離心去除。結(jié)果表明，用MTBE提取比脂質(zhì)提取的“金標(biāo)準(zhǔn)”—— Folch or bligh and dyer recipes效果更好。

對(duì)于只檢測(cè)總脂中的部分脂質(zhì)，固相萃取(SPE) 是一個(gè)較好的方法。Persson等[14]發(fā)展了利用C18柱和硅膠柱分離萃取腸液中磷脂、中性脂等包含游離脂肪酸的方法。譚力等[15]采用硅膠固相萃取柱萃取可以在短時(shí)間內(nèi)連續(xù)處理較多數(shù)量的樣品，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

3.2.2 脂質(zhì)的檢測(cè)方法 隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，脂類(lèi)的分析方法也在不斷的改進(jìn)?？傮w而言，大部分的分析技術(shù)都能用來(lái)分析脂質(zhì)，包括：脂肪酸、磷脂、神經(jīng)鞘磷脂、甘油三酯和類(lèi)固醇等。常規(guī)的薄層色譜(Thin layer chromatography， TLC)已被分辨率更好的色譜技術(shù)所取代。與其它研究方法相比，ESI/MS方法有其自身的特點(diǎn)：樣品前處理簡(jiǎn)單、分辨率高、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，適合對(duì)脂質(zhì)混合物(尤其是磷脂混合物)進(jìn)行快速、靈敏和高通量的定性定量研究[8， 16，17]。色質(zhì)聯(lián)用的引入極大地推動(dòng)了脂組學(xué)的發(fā)展，其中的核心技術(shù)就是ESI/MS，加上色譜等技術(shù)對(duì)樣品中脂質(zhì)分離的強(qiáng)化，實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)分離鑒定的高通量、高靈敏度和高效率。多維的質(zhì)譜技術(shù)在脂組學(xué)的研究中也取得了新的進(jìn)展[18]。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS) 適合檢測(cè)分子量小于500 Da的所有種類(lèi)脂質(zhì)分子。利用GCTOF技術(shù)平臺(tái)中的BinBase 和 SetupX，能夠一次性得到800種脂質(zhì)類(lèi)化合物中的80種物質(zhì)的半定量結(jié)果，并可根據(jù)FiehnLib的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證結(jié)果的可靠性[19]。

用于脂質(zhì)分析的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)主要包括：高效液相色譜芯片質(zhì)譜聯(lián)用 (High performance liquid chromatographychip/Mass spectrum， HPLCChip/MS)，超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 (Ultraperformance liquid chromatographyMass spectrum， UPLC/MS)，超高效液相色譜質(zhì)傅立葉變換質(zhì)譜聯(lián)用(Ultraperformance liquid chromatography/fourier transformMass spectrum， UPLC/FTMS)，液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid ChromatographyTime of Flight/Mass Spectrum， LCTOF/MS)。質(zhì)荷比為100～2000的脂質(zhì)輪廓都可以通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用方法得到。色譜技術(shù)可以使血漿或組織樣品中的干擾得到較好地分離，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，并對(duì)流動(dòng)相有一定要求。Pang等[1]建立了正相液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜分析血漿中腦磷脂(Glycerophosphoehtanolamine， PE)， 磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol， PG)， 磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol， PI)， 磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine， PS)， 磷酸卵磷酯 (Phosphatidylcholine， PC)， 鞘磷脂 (Sphingomyelin， SM) 和 溶血磷脂膽堿 (Lyso phosphatidylcholine， LysoPC)等7大類(lèi)磷脂的方法，定量分析正常人、糖尿病、糖尿病和腎病不同分期患者血漿樣品中7類(lèi)磷脂，并發(fā)現(xiàn)了7類(lèi)磷脂在糖尿病和腎病患者不同分期階段的變化規(guī)律，為糖尿病和腎病患者磷脂代謝研究提供了有效可靠的辦法。

nano ESIFT/MS是基于芯片技術(shù)的電噴霧傅立葉轉(zhuǎn)換質(zhì)譜(Nano electrospray fourier transform/Mass spectrum)，用于脂質(zhì)的快速分類(lèi)、半定量、結(jié)構(gòu)鑒定以及脂質(zhì)指紋圖譜的建立。利用NanoMate 芯片與高分辨率的傅立葉變換質(zhì)譜FTMS或Orbitrap 技術(shù)可以在1 min內(nèi)快速得到血漿和組織 (植物、人類(lèi)、細(xì)菌等) 的粗提物中脂質(zhì)的輪廓。Kraft等[20]建立了nano ESIFT MS對(duì)脂膜進(jìn)行分析的新方法，能在納米水平上測(cè)定膜上不同脂質(zhì)的分布，從而獲得“脂質(zhì)膜相結(jié)構(gòu)”的信息。大多數(shù)膜的脂質(zhì)分子組成是類(lèi)似的，平均只有20%的偏差。這種差別是由膜上脂質(zhì)分子的分類(lèi)機(jī)制決定的。Schneiter等[21]利用nanoESIMS/MS研究了釀酒酵母膜的脂質(zhì)分子組成，發(fā)現(xiàn)基于酰基鏈分類(lèi)機(jī)制維持了酵母細(xì)胞膜脂質(zhì)分子種類(lèi)的組成。Holz等[22]同時(shí)定性和定量了視網(wǎng)膜色素細(xì)胞中的脂褐素(Lipofuscin， LF)，定量結(jié)果表明，LF的含量隨著年齡的增長(zhǎng)與視網(wǎng)膜病情的嚴(yán)重程度升高，脂質(zhì)分子組成的改變會(huì)影響脂質(zhì)代謝以及脂質(zhì)物質(zhì)整體的深層變化。該方法為視網(wǎng)膜疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供了重要的技術(shù)支持。

3.2.3 脂組學(xué)研究的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù) 隨著脂組學(xué)的迅速發(fā)展過(guò)程，相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)也逐步建立?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)能夠查詢(xún)脂質(zhì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜信息、分類(lèi)及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)信息等，其功能也越來(lái)越完善。數(shù)據(jù)庫(kù)的建立無(wú)疑成為推動(dòng)脂組學(xué)自身發(fā)展的良好工具。最大的數(shù)據(jù)庫(kù)LIPID Maps，是由美國(guó)國(guó)立綜合醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)(National institute of general medical sciences， NIGMS)組織構(gòu)建的。它包含了脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息、質(zhì)譜信息、分類(lèi)信息、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等。數(shù)據(jù)庫(kù)中除了游離脂肪酸、膽固醇、甘油三酯、磷脂等8000余種單一脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息外，還包括了81個(gè)大類(lèi)、276個(gè)亞類(lèi)脂質(zhì)化合物的結(jié)構(gòu)信息。除此之外，不少?lài)?guó)家和科研團(tuán)隊(duì)也建立了自己的數(shù)據(jù)庫(kù) (脂組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)如表1所示)。表1 脂組學(xué)研究應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫(kù)

3.3 脂組學(xué)的研究現(xiàn)狀

3.3.1 脂組學(xué)在醫(yī)藥研發(fā)中的應(yīng)用 近年來(lái)，研究者對(duì)脂質(zhì)的研究興趣重新被激活，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用也使脂組學(xué)的發(fā)展日趨迅猛。脂質(zhì)是生物事件從膜運(yùn)輸?shù)酱x信號(hào)最基本的因子。脂質(zhì)代謝的擾動(dòng)與代謝紊亂和疾病的發(fā)展密切相關(guān)[6]。由于這些擾動(dòng)可能發(fā)生在分子水平，全面解決復(fù)雜脂質(zhì)的量化問(wèn)題變得非常必要。隨著液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展，基于四級(jí)桿飛行時(shí)間雜交質(zhì)譜儀 (QSTAR Pulsar) 的鳥(niǎo)槍脂組學(xué)已使復(fù)雜分子構(gòu)成的脂質(zhì)的同時(shí)定性與定量分析成為可能[23～25]。Ejsing等[26]得到了微量樣本的總脂提取物中數(shù)百種脂質(zhì)分子的定量輪廓。這一成果在實(shí)驗(yàn)室研究和制藥行業(yè)中，特別是在生物標(biāo)志物和藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程領(lǐng)域引起了極大的興趣，更高通量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可以預(yù)見(jiàn)的。高通量、半自動(dòng)化的方法學(xué)的新發(fā)展已經(jīng)開(kāi)始傾向于鳥(niǎo)槍脂組學(xué)的研究。機(jī)器人輔助樣本制備顯著提高了數(shù)據(jù)自動(dòng)解釋的效率，并能夠在數(shù)據(jù)質(zhì)量沒(méi)有任何損失的情況下完成大量樣本的分析。隨著鳥(niǎo)槍脂組學(xué)的不斷發(fā)展，豐度相當(dāng)小的脂質(zhì)分子的定量測(cè)定也是可以實(shí)現(xiàn)的。更多的脂質(zhì)輪廓的建立會(huì)加強(qiáng)磷脂在細(xì)胞膜和代謝功能障礙殊作用的解釋。這將有利于發(fā)現(xiàn)具有更好選擇性和非毒性的藥物靶點(diǎn)。Su等[2]發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣不依賴(lài)性磷脂酶A2(iPLA2)的表達(dá)對(duì)心肌缺血或心律不齊有重要影響。通過(guò)模擬和優(yōu)化與iPLA2特異結(jié)合的脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，有望找到一種有效的以iPLA2為靶蛋白的治療糖尿病、心肌炎的新藥。脂組學(xué)還能作為評(píng)價(jià)藥物療效的一個(gè)輔助手段。Huang等[27， 28]研究了甲基硝基亞硝基肌(NmethylNnitroNnitrosoguanidine， MNNG) 對(duì)SM的作用，發(fā)現(xiàn)MNNG不但能引起SM代謝的變化，而且SM代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶——酸性鞘磷脂酶出現(xiàn)由分散到集中于脂筏的趨勢(shì)。因此，逆轉(zhuǎn)脂代謝紊亂有利于疾病的治療，監(jiān)測(cè)藥物作用后機(jī)體內(nèi)脂代謝變化情況，及時(shí)反應(yīng)機(jī)體生理生化狀態(tài)的改變，有助于評(píng)價(jià)藥物的藥效及確定可能的副作用。

目前所面臨的挑戰(zhàn)則是精確找到脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)定義上的作用位點(diǎn)，精確指定每個(gè)不飽和脂肪酸雙鍵的位置，并對(duì)這些脂質(zhì)進(jìn)行高通量的量化。Thomas等[29]證實(shí)臭氧誘導(dǎo)解離技術(shù) (Ozoneinduced dissociation technology， OzID) 與鳥(niǎo)槍脂組學(xué)的整合應(yīng)用是非常有前途的。因此，高通量的鳥(niǎo)槍脂組學(xué)具有巨大的潛力，并會(huì)在細(xì)胞生物學(xué)、分子醫(yī)學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)和生物標(biāo)志物的診斷方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.3.2 脂生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn) 隨著分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，有關(guān)低豐度的脂質(zhì)分子分析與量化的方法已多有報(bào)道。運(yùn)用這些方法，代謝綜合癥和其它脂質(zhì)相關(guān)的疾病的生化機(jī)制得到明確闡釋。更重要的是，對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中脂質(zhì)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)有重要意義[30]。Brugger等[31]借助質(zhì)譜方法詳細(xì)分析了HIV與其宿主的膜脂組的差異，發(fā)現(xiàn)病毒富集二氫鞘磷脂(Dihydrosphingomyelin)，而且當(dāng)抑制宿主細(xì)胞的鞘脂質(zhì)合成途徑后，傳染率明顯下降，由此推斷這類(lèi)脂質(zhì)在HIV復(fù)制循環(huán)中起關(guān)鍵作用。通過(guò)系統(tǒng)研究病原體的脂質(zhì)組，還能有效地確定在宿主病原體交互作用時(shí)起作用的脂質(zhì)，進(jìn)而找到相關(guān)的致病途徑。Han等[32]運(yùn)用脂質(zhì)組學(xué)方法分析糖尿病鼠心肌線粒體膜脂急劇減少的細(xì)節(jié)，指出心肌磷脂及其直接的代謝前體(Phosphatidylglycerol， PG) 在糖尿病人并發(fā)心肌病時(shí)起關(guān)鍵作用，并以此為依據(jù)，提出了糖尿病心肌病在發(fā)病學(xué)上的一種可能代謝紊亂機(jī)制。

3.3.3 脂組學(xué)在疾病診斷中的應(yīng)用 發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的診斷指標(biāo)是進(jìn)行疾病診斷的關(guān)鍵。脂組學(xué)所提供的方法能夠監(jiān)測(cè)疾病患者與正常人之間的脂質(zhì)的變化，從其中找到差異較大的脂質(zhì)化合物，作為疾病早期診斷的指標(biāo)。Gadomska等[33]定量研究了4例健康的年紀(jì)相符的女性、64例卵巢癌患者和27例良性卵巢腫瘤患者血清中各種膽固醇及脂蛋白的含量變化。結(jié)果表明：以載脂蛋白AI (aPoAI) 和游離膽固醇 (FC) 為診斷指標(biāo)排除卵巢瘤的正確率高達(dá)95.5%，綜合aPoAI，F(xiàn)C，高密度脂蛋白游離膽固醇 (HDLFC)、高密度脂蛋白總膽固醇 (HDLTC)、載脂蛋白B (aPoB) 及高密度脂蛋白3 (HDL3) 片斷診斷卵巢癌的準(zhǔn)確率達(dá)到97%。另有研究報(bào)道溶血磷脂酸在卵巢癌的診斷中表現(xiàn)出高度的敏感性和特異性，能夠作為早期診斷卵巢癌及術(shù)后隨訪的生物學(xué)指標(biāo)[34]。

4 脂組學(xué)與代謝組學(xué)的關(guān)系

代謝組學(xué)與蛋白組學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)相互關(guān)聯(lián)共同組成整體的系統(tǒng)生物學(xué)。組學(xué)的研究是以物質(zhì)組為基礎(chǔ)的研究，是考察“系統(tǒng)”與“系統(tǒng)”的相互作用[35]。代謝組學(xué)則是研究生物體內(nèi)所有小分子代謝產(chǎn)物的一門(mén)學(xué)科，現(xiàn)在已經(jīng)派生出了糖組學(xué)、毒素組學(xué)和其它一些以單一化學(xué)物質(zhì)組為研究對(duì)象的分支，脂組學(xué)也是其中的成員之一 (如圖解2所示)。脂組學(xué)通過(guò)研究脂質(zhì)提取物，可以獲得脂質(zhì)組(Lipidome) 的信息，它反映了在特定生理狀態(tài)下脂質(zhì)的整體變化。研究生物體在正常狀態(tài)和疾病狀態(tài)下脂代謝的整體差異，識(shí)別疾病脂生物標(biāo)志物，結(jié)合相關(guān)酶的研究，就有可能深入地研究代謝途徑或致病機(jī)制，最終發(fā)展出有效的診斷和治療手段。

Scheme 2 Relationship between lipidomics and metabonomics代謝物是生理活動(dòng)中基因水平和蛋白質(zhì)水平調(diào)控的終端體現(xiàn)。因此，脂組學(xué)作為代謝組學(xué)的分支能與基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)相互結(jié)合， 對(duì)生物現(xiàn)象進(jìn)行不同層次的分析，加深對(duì)生命本質(zhì)的了解。脂組學(xué)可以借鑒代謝組學(xué)技術(shù)的整合運(yùn)用[36]，增加脂質(zhì)分析中的信息含量，通過(guò)多維的數(shù)據(jù)處理，建立其與蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)的數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。van Helemond等[37]結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和脂組學(xué)對(duì)血吸蟲(chóng)外殼膜的成分進(jìn)行分析，確定了血吸蟲(chóng)在進(jìn)行養(yǎng)分?jǐn)z取和免疫逃避時(shí)起作用的外殼上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)血吸蟲(chóng)外殼富集宿主缺乏的脂質(zhì)，而且外殼上富集的蛋白質(zhì)也與數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)其它物種表現(xiàn)的蛋白質(zhì)不同，這意味著可能是這些特殊的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成了外殼的獨(dú)特功能。但是，研究這些特殊蛋白的功能特征依然存在很大的挑戰(zhàn)，需要借助基因組學(xué)中的RNAi “擊倒” (RNAinterference“knock down”)技術(shù)[38， 39]，對(duì)其進(jìn)行表型鑒定，從而闡釋特異蛋白和脂質(zhì)的功能。因此，脂組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)的結(jié)合能夠更好地闡釋化合物在生物體內(nèi)的功能及作用機(jī)制。

5 展 望

脂組學(xué)自誕生以來(lái)發(fā)展迅猛，已經(jīng)在細(xì)胞生物學(xué)、疾病診斷、疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及醫(yī)藥研發(fā)等方面取得了相應(yīng)的進(jìn)展。但由于起步晚，其仍處于一個(gè)早期發(fā)展階段，存在許多機(jī)遇和挑戰(zhàn)。由于脂質(zhì)種類(lèi)繁多，相互作用復(fù)雜，現(xiàn)有的分析技術(shù)不能同時(shí)將生物樣本中的脂質(zhì)完全檢測(cè)出來(lái)。但是，脂組學(xué)所表現(xiàn)出來(lái)的巨大潛力不容忽視，特別是鳥(niǎo)槍脂組學(xué)的迅猛發(fā)展，加快了復(fù)雜脂質(zhì)分子的定性和高通量量化等問(wèn)題的解決。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，脂質(zhì)分析會(huì)登上一個(gè)新的臺(tái)階，人們對(duì)脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)將逐步加深，也將為遺傳和細(xì)胞生物學(xué)發(fā)現(xiàn)新的脂質(zhì)分子的作用機(jī)制提供可能的手段。此外，脂組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和完善對(duì)脂組學(xué)的研究將起到非常大的促進(jìn)作用。

近年來(lái)，代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展對(duì)脂組學(xué)的研究起到了積極的帶動(dòng)作用。脂組學(xué)與其它組學(xué)的整合不但為生物體中脂脂、脂蛋白質(zhì)及相關(guān)基因調(diào)控的相互作用提供數(shù)據(jù)支持，不斷完善著生物體的代謝網(wǎng)絡(luò)，為尋找致病機(jī)制及與其相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物提供新的手段，也為毒理學(xué)研究提供嶄新視角。可以說(shuō)，脂組學(xué)與蛋白組學(xué)、基因組學(xué)的整合運(yùn)用將增加脂質(zhì)研究的數(shù)據(jù)信息，為藥物研發(fā)、發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的臨床前和早期臨床階段了解脂質(zhì)功能提供了新的契機(jī)[40]。要充分發(fā)揮代謝組學(xué)研究的優(yōu)勢(shì)，從脂代謝水平研究疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的變化規(guī)律，尋找疾病相關(guān)的脂生物標(biāo)志物，進(jìn)一步提高疾病的診斷效率，并為疾病的治療提供更為可靠的依據(jù)。脂組學(xué)能夠在一定程度上促進(jìn)代謝組學(xué)的發(fā)展，并通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)的整合運(yùn)用建立與其它組學(xué)之間的關(guān)系，最終實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)生物學(xué)的整體進(jìn)步。

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第3篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法；生物胺類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)；氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)；腦組織

1引言

神經(jīng)遞質(zhì)（Neurotransmitter）在神經(jīng)化學(xué)傳遞中是充當(dāng)“信使”的特定化學(xué)物質(zhì)。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分為4類(lèi)，即生物胺類(lèi)、氨基酸類(lèi)、肽類(lèi)和其它類(lèi)。隨著神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)展，陸續(xù)在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了大量具有神經(jīng)活性的物質(zhì)。生物胺類(lèi)遞質(zhì)是最先發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，包括多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）、5羥色胺（5HT）。酪氨酸（Tyr）是DA、NE和E的前體，色氨酸（Try）是5HT的前體，在多種應(yīng)激情況下，維持正常的生物胺類(lèi)遞質(zhì)代謝和腦功能的發(fā)揮。5羥吲哚乙酸（5HIAA）是5HT代謝的產(chǎn)物，5HIAA的變化也可間接反應(yīng)5HT的變化。褪黑激素（Melatonin）主要是由哺乳動(dòng)物和人類(lèi)的松果體產(chǎn)生的一種胺類(lèi)激素，5HT在N乙酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下，轉(zhuǎn)化成N乙?；?羥色胺，最后合成Melatonin。生物胺類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在人體和哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)、心血管和內(nèi)分泌等組織系統(tǒng)中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用，參與情緒、情感、應(yīng)激行為和睡眠覺(jué)醒等多種生理過(guò)程[1＼]，含量的變化與人類(lèi)多種疾病密切相關(guān)，是診斷阿爾茨海默癥、唐氏綜合征、抑郁癥和帕金森等疾病的重要依據(jù)[2～5＼]。組胺（Histamine）是一種活性胺化合物，作為身體內(nèi)的一種化學(xué)傳導(dǎo)物質(zhì)，可以影響許多細(xì)胞的反應(yīng)，中樞組胺能神經(jīng)系統(tǒng)影響腦部神經(jīng)傳導(dǎo)，參與睡眠、荷爾蒙的分泌、體溫調(diào)節(jié)、食欲與記憶形成等功能[6＼]。乙酰膽堿（Ach）是中械堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其主要功能是維持意識(shí)的清醒，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用。被確定為神經(jīng)遞質(zhì)的氨基酸有γ氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、牛磺酸（Tau）和絲氨酸（Ser）[7＼]。谷氨酰胺（Gln）作為大腦的一種能量來(lái)源，具有保護(hù)大腦的功能，能改善心情、增強(qiáng)智力，并有益于長(zhǎng)期與短期記憶[8，9＼]。氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)具有重要作用，其含量及比例的變化與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[2～5，10＼]。因此，生物樣品中生物胺類(lèi)及氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于某些疾病的篩查、診斷和治療以及藥物在體內(nèi)的作用具有重要意義。

神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在生物樣品中的含量很低，而生物樣品本身基體復(fù)雜，內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多，因此高效快速的樣品前處理方法和高靈敏度的檢測(cè)手段是開(kāi)展神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)研究的難點(diǎn)。采用高效液相色譜分離，再以紫外、熒光、電化學(xué)和質(zhì)譜方法檢測(cè)，是測(cè)定神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)較常用的方法[11～21＼]。由于氨基酸無(wú)紫外吸收，用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需對(duì)氨基酸進(jìn)行柱前或柱后衍生[16～20＼]。生物胺類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)為強(qiáng)極性化合物，在反相色譜柱上保留極弱，對(duì)熒光和質(zhì)譜的響應(yīng)信號(hào)較弱，可通過(guò)衍生化處理改善色譜保留行為和離子化效率[16～19，21＼]。但衍生操作步驟繁瑣，耗時(shí)耗力，而且衍生程度也難以保證，JP衍生反應(yīng)還可能生成非目標(biāo)衍生物，這些對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定都會(huì)產(chǎn)生影響。目前，HPLCMS/MS兼具分離能力強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，已逐漸發(fā)展成為復(fù)雜生物體系中痕量生物活性物質(zhì)分析的強(qiáng)有力手段[22～26＼]。

本研究采用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法建立了對(duì)大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類(lèi)及氨基酸類(lèi)共17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)同時(shí)快速分析的方法。本方法的選擇性和重現(xiàn)性好，靈敏度高，并且無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化和固相萃取等復(fù)雜的前處理，簡(jiǎn)化了分析步驟，提高了分析效率。對(duì)比了兩種不同腦組織樣品前處理方法對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。本方法可應(yīng)用于腦組織中生物胺類(lèi)及氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分析測(cè)定，為臨床檢測(cè)提供了有效的樣品前處理方法和檢測(cè)手段。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

DionexUltimate3000超高效液相色譜儀TSQEndura三重四極桿質(zhì)譜儀，Hypercarb色譜柱（100mm×2.1mm，5μm）（ThermoScientific公司）；電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BioGenPRO200型精密勻漿器（PROScientific公司）；EppendorfAG22331Hamburg離心機(jī)（GermanyEppendorf公司）。

多巴胺（DA）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5HT）、5羥吲哚乙酸（5HIAA）、褪黑激素（Melatonin）、γ氨基丁酸（GABA）、酪氨酸（Tyr）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）、?；撬幔═au）、絲氨酸（Ser）、色氨酸（Try）、乙酰膽堿（ACh）、組胺（Histamine）對(duì)照品均購(gòu)于Sigma公司；甲醇和甲酸（色譜純，F(xiàn)isher公司）；實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。

Wistar大鼠20只（雄性，體重180～200g），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1色譜條件流動(dòng)相A：0.1%甲酸；流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.2mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：2μL；梯度洗脫：0～3min，0%B；3～10min，0%～100%B；10～12min，100%～0%B。10～12min流出物切換至廢液，不進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。

2.2.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式，多反應(yīng)檢測(cè)（MRM），毛細(xì)管電壓為3.0kV，離子傳輸管溫度為300℃；霧化器溫度為300℃；鞘氣流速35arb；輔助氣流速5arb。質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示。

2.2.3對(duì)照品溶液的配制分別準(zhǔn)確稱(chēng)取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh、Histamine對(duì)照品各5mg，以0.1%甲酸溶解，分別定容至5mL，配成濃度為1mg/mL溶液。

2.2.4供試樣品的處理腦組織樣品前處理方法A：取大鼠斷頭處死，冰臺(tái)上立即取腦，放于冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干生理鹽水，將腦置于冰臺(tái)上迅速剝離海馬體與大腦皮層，稱(chēng)重。冰冷的0.1%甲酸加入到腦組織中，按1KG-3∶KG-510（V/W）勻漿。4℃下，12000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

腦組織樣品前處理方法B[26＼]：取大鼠斷頭處死，立即取腦，置于80℃水浴2min后取出，用濾紙吸干水，迅速剝離海馬體與大腦皮層，稱(chēng)重。冰冷的0.3%甲酸乙腈加入到腦組織中，按1KG-3∶KG-510（V/W）勻漿。4℃下，12000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

3結(jié)果與討論

3.1色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh，Histamine對(duì)照品的1mg/mL溶液，以0.1%甲酸溶液稀釋至5μg/mL。采用直接進(jìn)樣方式，電噴霧離子源（ESI），優(yōu)化各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)三重四極桿質(zhì)譜分析條件，分別嘗試正、負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓為2.0～5.0kV；離子傳輸管溫度為200～400℃；霧化器溫度為200～400℃；鞘氣流速20～50arb；輔助氣流速0～10arb。并自動(dòng)優(yōu)化各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）時(shí)所產(chǎn)生的碎片離子種類(lèi)和豐度以及所需碰撞能量。

色譜條件優(yōu)化，考慮到所分析神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的極性較強(qiáng)、水溶性^好和在色譜柱上的保留問(wèn)題，嘗試了不同類(lèi)型的色譜柱（C8、C18和Hypercarb），Hypercarb色譜柱以多孔石墨化碳為固定相，對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留和分離效果更好，且在不同梯度洗脫時(shí)，在100%水相條件下，保持穩(wěn)定的保留和分離；考慮神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的離子化效率較低的問(wèn)題，比較了純水和不同濃度甲酸溶液作為流動(dòng)相對(duì)分離、分析效果的影響，結(jié)果表明，0.1%甲酸為流動(dòng)相時(shí)分析效果更佳。最終建立了無(wú)需衍生化、對(duì)腦組織樣品中17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)同時(shí)定量分析的UPLCMS/MS方法。

3.2方法學(xué)考察

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限采用外標(biāo)法定量，各取適量按照上述方法配制的對(duì)照品溶液混合，再根據(jù)需要用0.1%甲酸溶液逐級(jí)稀釋成不同濃度的系列混合對(duì)照溶液。以待測(cè)物濃度作為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，得到17種待測(cè)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的線性回歸方程。以信噪比（S/N）>10確定方法的定量限（LOQ）。各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限結(jié)果列于表2。

3.2.2精密度配制高、中、低3個(gè)濃度水平的混合對(duì)照品溶液，平行測(cè)定6次，計(jì)算各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)峰面積的RSD，測(cè)得日內(nèi)精密度（Intradayprecision）。連續(xù)測(cè)定3日，計(jì)算各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)峰面積的RSD，測(cè)得日間精密度（Interdayprecision）。測(cè)定結(jié)果如表2所示。LM

3.2.3加標(biāo)回收率

取同一腦組織樣品勻漿液，分別加入高、中、低3個(gè)濃度水平的混合對(duì)照品溶液，按照2.2.4節(jié)中樣品處理方法A操作，平行測(cè)定6次，計(jì)算各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的加標(biāo)回收率（Recovery），結(jié)果如表2所示。

3.2.4重復(fù)性取同一腦組織樣品勻漿液6份，按照2.2.4小節(jié)中樣品處理方法A操作，平行測(cè)定6次，計(jì)算各神經(jīng)遞化學(xué)物質(zhì)峰面積的RSD，測(cè)得重復(fù)性（Repeatability），結(jié)果如表2所示。

3.3腦組織樣品前處理方法比較結(jié)果

大鼠大腦皮層中17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)經(jīng)UPLCMS/MS分析所得的提取離子流圖如圖1所示。不同前處理方法下大鼠海馬和大腦皮層中17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量水平結(jié)果如表3所示。所測(cè)4組樣品均檢測(cè)到待測(cè)的17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，經(jīng)方法A處理的海馬和大腦皮層中5HT、Melatonin、GABA、Gln、Glu、Ser、Gly、Asp、Tyr和Try的測(cè)得含量顯著高于經(jīng)方法B處理的海馬和大腦皮層中的測(cè)得含量；DA、E、NE、5HIAA、ACh、Histamine和Tau的測(cè)得含量在經(jīng)方法A處理的海馬和大腦皮層中略高于經(jīng)方法B處理的海馬和大腦皮層。綜上所述，腦組織樣品前處理方法A優(yōu)于方法B。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLCMS/MS法對(duì)大鼠海馬與大腦皮層中生物胺類(lèi)及氨基酸類(lèi)17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)同時(shí)快速檢測(cè)的方法。利用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，分別優(yōu)化液相色譜和質(zhì)譜條件，選擇合適的電離模式，對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)檢測(cè)的6種生物胺類(lèi)和11種氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)分別選擇一對(duì)定性離子對(duì)和定量離子對(duì)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分離、提取及確證，實(shí)現(xiàn)了它們的定量分析。此方法可在10min內(nèi)完成17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)同時(shí)分析，檢測(cè)時(shí)間短、線性關(guān)系較好、方法回收率高、穩(wěn)定性良好，滿足分析要求。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠海馬和大腦皮層前處理方式進(jìn)行探究，對(duì)比了兩種樣品前處理方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冷環(huán)境處理方式下測(cè)得大鼠海馬與大腦皮層中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量較高，此方法無(wú)需衍生化、操作簡(jiǎn)單、可直接測(cè)定。

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AbstractAnultraperformanceliquidchromatographytandemmass（UPLCMS/MS）spectrometrymethodwasestablishedfordeterminationofthecontentsofbioamineandaminoacidneurochemicalsinhippocampusandcerebralcortexofrat.Hypercarbcolumn（100mm×2.1mm，5μm）wasusedforthesampleseparationwith0.1%formicacidmethanolasthemobilephaseundergradientelution.TheneurochemicalsweredetectedbyMS/MSusingESIionsourceunderpositiveionizationmodewithMRMscan.Bothquantificationandconfirmationionswerechosenforeach6bioamineand11aminoacidneurochemicals.Theinfluenceoftwodifferentprocessingmethodsonthecontentsofneurochemicalsinbraintissueswascompared.Total17neurochemicalsweresimultaneouslydetectedin10min.Thecalibrationcurvewaswithagoodlinearrelationship.Theintradayandinterdayprecision，averagerecoveryandrepeatabilitycouldmeettheanalysisrequirement.ThisUPLCMS/MSmethodshowsexcellentselectivity，accuracy，highsensitivity，specificityandgoodrepeatability，andissuitablefortheseparationandquantizationofbioamineandaminoacidneurochemicalsinbraintissue.

第4篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞：氣質(zhì)聯(lián)用儀；氣體分析；應(yīng)用

中圖分類(lèi)號(hào)：O659 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20150940009

隨著氣體制造和應(yīng)用技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，對(duì)于氣質(zhì)聯(lián)用儀器分析方法也提出了相當(dāng)高要求，也就是電子工業(yè)中標(biāo)準(zhǔn)氣體對(duì)于氣體純度要求越來(lái)越高，氣體的組成部分也非常復(fù)雜，一般分析很難達(dá)到衡量雜志要求標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)技術(shù)發(fā)展迅速，分析具有一定靈敏度，樣品量、分析速度加快、分離和鑒定也有很多有點(diǎn)，技術(shù)應(yīng)用范圍也在涉及到了化學(xué)、化工、環(huán)境和能源等很多領(lǐng)域，同時(shí)還有儲(chǔ)糧糙米和稻谷釋放氣體方面也有很多研究課題。

1 氣體聯(lián)用儀的工作原理

混合物樣品經(jīng)過(guò)色譜柱分離進(jìn)入質(zhì)譜儀離子，在離子源被電離成為離子時(shí)，離子經(jīng)過(guò)質(zhì)量分析器和檢測(cè)器成為質(zhì)譜信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，樣品由色譜柱不斷流入到離子源里，離子由離子源質(zhì)量分析器然后設(shè)定好分析器質(zhì)量范圍，計(jì)算并采集到質(zhì)譜。這樣計(jì)算機(jī)就可以自動(dòng)將每一個(gè)質(zhì)譜中離子強(qiáng)度相加，顯示出總體離子強(qiáng)度，隨著時(shí)間變化曲線中總離子色譜圖形狀和一般色譜圖能夠相互一致，這樣就是質(zhì)譜檢測(cè)器的色譜圖。

質(zhì)譜儀掃描方式一般有兩種，全掃描和選擇離子掃描，前者是制定質(zhì)量范圍中離子掃描記錄，能夠最終得到一個(gè)正常的質(zhì)譜圖，也就是質(zhì)譜圖提供未知圖。另一個(gè)就是選擇離子檢測(cè)，只針對(duì)選定離子進(jìn)行檢測(cè)，離子不被記錄，最大優(yōu)點(diǎn)就是對(duì)于離子進(jìn)行選擇性檢測(cè)，對(duì)于不相關(guān)離子統(tǒng)統(tǒng)都被排擠在外，后者的檢測(cè)靈敏度比較高，是普通的一百倍，但是缺點(diǎn)就是不能得到非常完整的質(zhì)譜圖，所以不能用來(lái)對(duì)于未知物的定性分析使用，它的主要用途是定量分析，可以把全掃描方式出的復(fù)雜色譜圖變簡(jiǎn)單，消除造成干擾的因素，對(duì)于被測(cè)部分影響可以降低主峰，一般都采用切割技術(shù)，或者使用氣路相對(duì)比較復(fù)雜的技術(shù)，通過(guò)離子選擇技術(shù)來(lái)避開(kāi)主體。

2 對(duì)于進(jìn)樣方法的選擇

由于分析樣品比較復(fù)雜，所以對(duì)于氣體和液體樣品來(lái)說(shuō)，氣體進(jìn)樣通常都使用六通進(jìn)樣方法，液體取樣一般采用的是注射方法，但是對(duì)于液化氣體就比較麻煩，因?yàn)閴毫Ρ容^高，所以采用注射方法，這樣就可以使得儀器適用于檢測(cè)不同的樣品。色譜分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集同時(shí)進(jìn)行，使得每一個(gè)分組得到分離鑒定，設(shè)置合適的色譜和質(zhì)譜分析方法，色譜條件包括色譜柱、固定液化、氣化溫度和溫升程序等，設(shè)置原則是一般情況使用毛細(xì)管，非極性樣品采用級(jí)毛細(xì)管柱，使用后再進(jìn)行調(diào)整，質(zhì)譜條件包括電離和電子電流等方面內(nèi)容，一般都是根據(jù)樣品情況進(jìn)行設(shè)定，保護(hù)燈絲，設(shè)定質(zhì)譜條件后還要進(jìn)行溶劑去除，通過(guò)離子源打開(kāi)燈絲。

3 氣質(zhì)聯(lián)用儀在糙米和稻谷釋放氣體中應(yīng)用

氣質(zhì)聯(lián)用儀憑借氣相色譜選擇性和質(zhì)量分析器靈敏性廣泛被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)與糧食行業(yè)中，對(duì)于離子源選擇、進(jìn)樣技術(shù)選擇、質(zhì)量分析器選擇等方面都使用質(zhì)量分析器。對(duì)于不同的溫度和濕度條件儲(chǔ)藏稻谷進(jìn)行微生物活動(dòng)監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，稻谷在30℃，濕度在70%～80%度之間，微生物活動(dòng)水平相對(duì)比較低，當(dāng)儲(chǔ)藏環(huán)境濕度超過(guò)80%時(shí)，就會(huì)影響到稻谷和糙米表面微生物，糧層濕度會(huì)擴(kuò)散。氣相色譜是一種很有效的分離分析方法，定性方面存在很多弊端問(wèn)題，就是在殘留分析方面，質(zhì)譜儀定性上有非常重要作用，氣質(zhì)聯(lián)用儀能夠提供可信的定性信息，氣相色譜和多級(jí)質(zhì)譜的選擇性，可以消除基質(zhì)影響，廣泛應(yīng)用于水稻殺蟲(chóng)劑、除草劑、殺菌劑和稻谷熏蒸劑中，各種藥劑之間不同物理特性，也會(huì)受到一定條件影響，檢測(cè)儀器，樣品制備方法等都受到不同選擇，氣質(zhì)聯(lián)用是常用靈敏檢測(cè)手段，已經(jīng)成為藥劑殘留檢測(cè)重要的技術(shù)手段，氣質(zhì)聯(lián)用現(xiàn)在有不少科研人員都在使用。

4 氣質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)量分析器選擇

氣質(zhì)聯(lián)用儀一般有四級(jí)桿，主要就是飛行時(shí)間和扇形磁場(chǎng)檢測(cè)器，單獨(dú)的四級(jí)，只是用來(lái)分析器掃描工作，適合于分析小分子和多電荷大分子，該質(zhì)量法分辨儀器保留時(shí)間接近，質(zhì)量相差幾個(gè)數(shù)量，因而影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性。氣質(zhì)聯(lián)用常常會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題，可以誘導(dǎo)相同濃度的藥劑在基質(zhì)溶液中的色譜值數(shù)據(jù)，就會(huì)造成溶劑標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算含量變化，基質(zhì)誘導(dǎo)效用就會(huì)成為假陽(yáng)性結(jié)果，使得揮發(fā)組沉淀物質(zhì)和熱變形基質(zhì)對(duì)于色譜柱的污染會(huì)造成很多影響，可以減少難揮發(fā)化合物和不穩(wěn)定化合物抑制基質(zhì)誘導(dǎo)方法。

對(duì)稻谷和糙米等儲(chǔ)糧品種的儲(chǔ)藏安全進(jìn)行研究，在實(shí)踐中主要難點(diǎn)問(wèn)題就是相同溫度條件，稻谷和糙米本身會(huì)發(fā)生很多生物化學(xué)變化，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致品質(zhì)變化，另外就是霉菌會(huì)使得稻谷和糙米品質(zhì)劣變，最主要因素就是濕度過(guò)大，就容易導(dǎo)致霉菌產(chǎn)生，對(duì)于稻谷和糙米呼吸作用總體來(lái)說(shuō)儲(chǔ)藏結(jié)構(gòu)與原理，受到環(huán)境、氣候和通風(fēng)條件限制，糧倉(cāng)溫度和濕度會(huì)發(fā)生變化，非常容易造成糧食發(fā)霉情況，針對(duì)這一問(wèn)題，可以選用智能化多參數(shù)糧情檢測(cè)方法，把糧食儲(chǔ)存情況做智能記錄，使得整個(gè)系統(tǒng)都能夠正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

5 氣質(zhì)聯(lián)用的改進(jìn)方法

氣質(zhì)聯(lián)用適用于分析非極性和揮發(fā)性成分，對(duì)于極性和非揮發(fā)性穩(wěn)定性較差的，氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥極性熱不穩(wěn)定農(nóng)藥，這類(lèi)檢測(cè)一般都使用液質(zhì)聯(lián)用，某些有機(jī)磷農(nóng)藥也屬于極性農(nóng)藥，氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致回收率低現(xiàn)象發(fā)生，就限制了氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀檢測(cè)靈敏度應(yīng)用范圍，對(duì)于揮發(fā)性不穩(wěn)定性農(nóng)藥有很多突破。

利用兩個(gè)色譜保持真空狀態(tài)下，連接分析色譜柱和進(jìn)樣口，保持常壓狀態(tài)下，使用傳統(tǒng)分析方法拖尾柱藥劑改善峰形，提高藥劑檢測(cè)限，然后影響到色譜柱分離能力，分離同分異構(gòu)體上，使得這些分異構(gòu)體有很低的分辨率，優(yōu)化條件實(shí)現(xiàn)快速和高靈敏特點(diǎn)。

氣相色譜和四級(jí)桿、離子飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀器都已經(jīng)廣泛被應(yīng)用，氣相色譜串聯(lián)實(shí)驗(yàn)室分析最常見(jiàn)和最熟悉的檢測(cè)方法，就是許多標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)使定性簡(jiǎn)單，氣相色譜在低壓條件下結(jié)合很多技術(shù)是氣質(zhì)聯(lián)用儀未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。色譜柱的安裝應(yīng)該嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行操作，切割時(shí)候應(yīng)該使用專(zhuān)用陶瓷技術(shù)，割面要平整，對(duì)于不同規(guī)格毛細(xì)管柱要選用不同石墨，還要多注意端口和質(zhì)譜不能混合，對(duì)于儀器公司提供的工具要進(jìn)行專(zhuān)門(mén)工具比對(duì)，一般可以使用接質(zhì)譜前先開(kāi)機(jī)方式，看看是否有氣泡溢出等，防止造成固定液被氧化流失而損壞色譜柱。另外對(duì)氣質(zhì)聯(lián)用儀要及時(shí)進(jìn)行改進(jìn)，對(duì)于極性和非揮發(fā)性不穩(wěn)定組分要進(jìn)行氨基甲酸酯農(nóng)藥檢測(cè)工作。

6 結(jié)論

質(zhì)譜法可以有效定性分析很多復(fù)雜有機(jī)化合物，不論是對(duì)于儲(chǔ)糧稻谷還是糙米釋放出氣體，都能很好分離和分析出方法，特別是適合于進(jìn)行有機(jī)化合物定量分析，但是一般的定性分析比較困難，這兩者有效結(jié)合必將會(huì)為化學(xué)家和生物學(xué)家提供一個(gè)先進(jìn)的復(fù)雜有機(jī)化合物處理器，可以成為一種很好定性和定量分析出樣品的工具。也可以將兩種方法進(jìn)行相互結(jié)合，使用聯(lián)用技術(shù)將氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)合起來(lái)，也就是氣質(zhì)聯(lián)用儀，被廣泛應(yīng)用于分離和鑒定各種物質(zhì)，具有高度靈敏度和分辨率，生物樣品藥物和代謝物定量也具有一定工具效能。

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第5篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)中已經(jīng)得到越來(lái)越多的應(yīng)用。在蛋白質(zhì)組學(xué)中以下三項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)步對(duì)于實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展將具有決定性的影響[2~5]。

1•1蛋白質(zhì)的分離技術(shù)

在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用分離技術(shù)有兩個(gè)目的。第一,通過(guò)將蛋白質(zhì)的混合物分離成單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)小組以簡(jiǎn)化復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物;第二,通過(guò)標(biāo)記的方法可以比較兩個(gè)蛋白質(zhì)的混合物樣品中蛋白質(zhì)的不同表現(xiàn)。其中主要的技術(shù)有雙向電泳(two-dmiensionalgelelectrophoresis,2-DE)、高效液相層析(high-performanceliquidchromatography,HPLC)、毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)、親和層析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmi-croarray)、磁性微球(magneticbeads)和免疫組等。特別是蛋白芯片和磁性微球兩項(xiàng)新的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)克服了以往技術(shù)的缺點(diǎn),具有高靈敏度、高通量、結(jié)果重復(fù)性好(CV<5~10%)、可機(jī)械化操作和方法靈活等特點(diǎn)。待測(cè)樣品來(lái)源廣泛,不需作特殊前處理,可以直接點(diǎn)樣檢測(cè),如血清、尿液及組織液等;檢測(cè)快速,一般一例標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)間僅需約5min,從標(biāo)本制備到出結(jié)果全過(guò)程僅約1h。蛋白芯片和磁性微球兩項(xiàng)新的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)有可能在體液中潛在腫瘤標(biāo)志(tumormarker)檢測(cè)方面創(chuàng)造革命性突破。

1•2生物質(zhì)譜(biologicalmassspectrometry)技術(shù)

生物質(zhì)譜是化學(xué)領(lǐng)域中非常重要的一種分析方法。它通過(guò)測(cè)定分子質(zhì)量和相應(yīng)的離子電荷實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中分子的分析。19世紀(jì)末科學(xué)家已經(jīng)奠定了這種方法的基礎(chǔ),1912年科學(xué)家第一次利用它獲得對(duì)分子的分析結(jié)果。在質(zhì)譜分析領(lǐng)域,已經(jīng)出現(xiàn)了幾項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)成果,其中包括氫同位素氘的發(fā)現(xiàn)(1934年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)成果)和碳60的發(fā)現(xiàn)(1996年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)成果)。不過(guò),最初科學(xué)家只能將它用于分析小分子和中型分子,由于生物大分子比水這樣的小分子大成千上萬(wàn)倍,因而將這種方法應(yīng)用于生物大分子難度很大。美國(guó)科學(xué)家約翰•芬恩與日本科學(xué)家田中耕一在傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析法基礎(chǔ)上發(fā)明了一種新方法:對(duì)生物大分子的質(zhì)譜分析法。首先將成團(tuán)的生物大分子拆成單個(gè)的生物大分子,并將其電離,使之懸浮在真空中,然后讓它們?cè)陔妶?chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)。不同質(zhì)量的分子通過(guò)指定距離的時(shí)間不同,質(zhì)量小的分子速度快些,質(zhì)量大的分子速度慢些,通過(guò)測(cè)量不同分子通過(guò)指定距離的時(shí)間,就可計(jì)算出分子的質(zhì)量。蛋白質(zhì)組學(xué)常用的生物質(zhì)譜有五種,分別簡(jiǎn)介如下。

1•2•1電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS):在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓,所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴,隨著溶劑蒸發(fā),液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大,最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子,致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子,使質(zhì)量電荷比(masstochargeratio,m/z)降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍,因而大大擴(kuò)展了分子質(zhì)量的分析范圍,離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。

1•2•2基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtmieoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理:將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體,當(dāng)用激光照射晶體時(shí),由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收能量,導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱,從而使基質(zhì)晶體升華,致使連同分析物一起進(jìn)入氣相。MALDI-TOF-MS所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子,因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。MALDI-TOF-MS與蛋白芯片分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為表面增強(qiáng)激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtmieoffightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)。

1•2•3快原子轟擊質(zhì)譜(fastatombomebardmentmassspectrometry,FABMS):一種軟電離技術(shù),應(yīng)用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品,使樣品離子濺出進(jìn)入分析器。這種軟電離技術(shù)適于極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定的化合物的分析,特別適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。

1•2•4同位素質(zhì)譜:一種開(kāi)發(fā)和應(yīng)用比較早的技術(shù),被廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,但它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用只是近幾年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力,該化合物又易于用同位素標(biāo)示,人們就想到用同位素質(zhì)譜的方法檢測(cè)其代謝物中同位素的含量以達(dá)到檢測(cè)該病原菌的目的,同時(shí)也為同位素質(zhì)譜在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了一條思路。

1•2•5免疫組質(zhì)譜(mimunomicmassspectrometry,IMS):質(zhì)譜與抗體分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。免疫組質(zhì)譜檢測(cè)(mimunomicmassspectrometryanalysis,IMSA)的定義為一組多種(類(lèi))抗體與質(zhì)譜聯(lián)合來(lái)精確地鑒別變異或修飾生物標(biāo)志群的方法。在一個(gè)抗體組基質(zhì)上同時(shí)捕獲多個(gè)生物標(biāo)志,并對(duì)捕獲的變異或修飾的生物標(biāo)志進(jìn)行質(zhì)譜精確分析。可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)生物標(biāo)志群。免疫組質(zhì)譜檢測(cè)的主要優(yōu)點(diǎn)為節(jié)省生物標(biāo)志的排序鑒定及鑒別變異或修飾的生物標(biāo)志。在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用比較廣泛的是電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS),這兩項(xiàng)質(zhì)譜技術(shù)都能與多種分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,例如LC-MS、CE-MS和SELDI-TOF-MS等。質(zhì)譜技術(shù)在未來(lái)幾年的實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)研究中必然會(huì)像SDS-PAGE一樣普遍和重要。

1•3蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展離不開(kāi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)展及檢索方法的改進(jìn),同時(shí)由于蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,使得蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)日益豐富。數(shù)據(jù)庫(kù)的專(zhuān)一性和綜合性越來(lái)越強(qiáng),而且通過(guò)生物信息學(xué)的應(yīng)用,可以對(duì)多個(gè)不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行銜接。蛋白質(zhì)組學(xué)常用的數(shù)據(jù)庫(kù)按研究?jī)?nèi)容可以分為兩類(lèi):結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和系統(tǒng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)功能等數(shù)據(jù)庫(kù),這類(lèi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)主要提供蛋白質(zhì)的序列、功能、主要結(jié)構(gòu)等信息以幫助鑒定蛋白質(zhì),如NCBInr,Genpept,SwissProt,OwlanddbEST等數(shù)據(jù)庫(kù)。系統(tǒng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)包括雙向凝膠電泳及蛋白質(zhì)指紋圖譜庫(kù)等,這類(lèi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)主要提供生命體各個(gè)系統(tǒng)或器官的總體蛋白質(zhì)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)變化幫助對(duì)某個(gè)系統(tǒng)內(nèi)或疾病中的全景的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行觀察,如expasy.ch、等數(shù)據(jù)庫(kù)。

2蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)用于疾病的檢測(cè)[6~9]

2006年10月28日美國(guó)長(zhǎng)灘HUPO第五屆世界年會(huì)上提出疾病生物標(biāo)志(biomarker)的研究分為三個(gè)階段:發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)志、鑒定疾病生物標(biāo)志、驗(yàn)證疾病生物標(biāo)志。目前在臨床疾病檢查及診斷方面已建立了生化檢查、器械檢查、免疫及遺傳學(xué)檢查、手術(shù)及病理檢查等多種多樣的方法。但在疾病早期或受各種因素干擾而未出現(xiàn)癥狀或體征前,這些檢測(cè)方法多不靈敏或特異,難以對(duì)病人作出及時(shí)正確的診斷。而蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在對(duì)臨床疾病檢測(cè)時(shí),抓住絕大多數(shù)疾病都有特異的生物標(biāo)志的本質(zhì),進(jìn)行疾病監(jiān)測(cè)和識(shí)別。即可對(duì)生物標(biāo)志做直接鑒定,故優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELSIA)、免疫熒光試驗(yàn)等間接測(cè)定生物標(biāo)志的方法。同時(shí),還有一套靈敏的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)和識(shí)別這些微量生物標(biāo)志;因而決定了它在臨床檢測(cè)中的敏感性和準(zhǔn)確性。從理論上推論,任何有生物標(biāo)志表達(dá)的疾病都應(yīng)能被檢出,并作出及時(shí)診斷。在過(guò)去五年里,部分病例檢測(cè)和研究驗(yàn)證了此設(shè)想,特別是在腫瘤檢測(cè)方面取得了突破性進(jìn)展。

2•1腫瘤檢測(cè)

2004年,美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所(NCI)組織的早期疾病探測(cè)研究機(jī)構(gòu)(EDRN)多中心(6大機(jī)構(gòu))三期臨床實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:通過(guò)血清及儀器標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控,蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是目前最有希望的腫瘤早期檢測(cè)方法[10]。據(jù)國(guó)內(nèi)外對(duì)12種腫瘤血清及尿液檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì),蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測(cè)敏感性和特異性均為80%~90%,明顯高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法,故蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)特別對(duì)評(píng)估傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物陰性的惡性腫瘤有意義[11]。

2•1•1肝癌:中國(guó)目前有1•3億乙型肝炎的病原攜帶者,其中包括2300萬(wàn)乙型肝炎引起的肝硬化患者。肝細(xì)胞性肝癌主要由乙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化引起。目前用于輔助診斷肝癌的甲胎蛋白試劑盒的特異性與敏感性都很差,無(wú)法用于鑒別肝癌與肝硬化。Liu等[12~13]在2003年《美國(guó)第94屆腫瘤年會(huì)》上正式報(bào)道蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)可鑒別由乙型肝炎引起的肝硬化與肝癌。通過(guò)分析血清蛋白質(zhì)指紋峰,發(fā)現(xiàn)下述五種蛋白質(zhì)指紋(2045,3935,4469,8687及8933u)可以用于區(qū)分乙型肝炎肝硬化與肝癌(P<0•001)。鑒定蛋白峰8933u為C3a-desArg。用已知的五項(xiàng)蛋白質(zhì)指紋,雙盲驗(yàn)證乙肝引起肝硬化與肝癌敏感性為91%,特異性為89%。用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)也可鑒別由丙型肝炎引起的肝硬化與肝癌。Ward等[14]通過(guò)分析182例丙型肝炎引起肝硬化與肝癌,雙盲測(cè)試丙型肝炎引起肝硬化與肝癌敏感性為94%,特異性為86%。肝硬化的治療方法是保守治療,而肝癌必須通過(guò)手術(shù)治療,蛋白質(zhì)指紋方法準(zhǔn)確率為85%~90%。因此,這是目前最好的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)方法。

2•1•2乳腺癌:Li等[15]2002年發(fā)表了通過(guò)蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)三個(gè)腫瘤標(biāo)志BC1(4•3ku),BC2(8•1ku)和BC3(8•9ku)來(lái)聯(lián)合檢測(cè)乳腺癌。Mathelin等[16]通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)驗(yàn)證這些腫瘤標(biāo)志的真實(shí)有效性,在49例乳腺癌,13例良性疾病和27例健康婦女中進(jìn)行測(cè)試。BC2腫瘤標(biāo)志有效性未得到確定,但是發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)蛋白峰BC1a(4286u)和BC1b(4302u)能與Li的BC1相對(duì)應(yīng),在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)(分別是P<0•00007和P<0•0002)。同樣BC3a(8919u)和BC3b(8961u)兩個(gè)蛋白峰能與Li的BC3相對(duì)應(yīng),在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)(分別是P<0•02和P<0•0002)。使用BC1a/BC1b/BC3a/BC3b的組合對(duì)乳腺癌的檢測(cè)準(zhǔn)確性達(dá)33%和45%,相同的樣品用CA153檢測(cè)準(zhǔn)確率僅為22%。結(jié)合BC1a/BC1b/BC3a/BC3b的組合和CA153增加了乳腺癌檢測(cè)的敏感性?？傮w來(lái)說(shuō),實(shí)驗(yàn)證明Li的研究結(jié)果BC1和BC3在對(duì)乳腺癌檢測(cè)中是具有幫助的。

2•1•3卵巢癌:CA125是一種廣泛用于卵巢癌檢測(cè)的較好的輔助診斷方法,但該抗原多在晚期病人中才能檢測(cè)出來(lái),Ⅰ期病人僅50%~60%陽(yáng)性。因此,病人經(jīng)臨床確診時(shí)多為晚期,五年存活率僅約35%。美國(guó)癌癥研究所等最早應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行卵巢癌檢測(cè)和研究,經(jīng)對(duì)50例卵巢癌病人(包括18例臨床診斷Ⅰ期病人),66例非惡性腫瘤病人及63名正常人進(jìn)行血清檢測(cè),結(jié)果顯示,敏感性100%,特異性95%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值94%[17]。提示采用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對(duì)卵巢癌病人進(jìn)行早期檢測(cè),可大大提高她們的五年存活率[18]。

2•1•4前列腺癌:前列腺特異性抗原(PSA)是目前檢測(cè)前列腺癌主要的敏感參考指標(biāo),雖然它的敏感性很高,不容易漏診,但特異性?xún)H20%~40%,如在許多良性前列腺肥大病人中PSA亦增高。然而,應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù),通過(guò)檢測(cè)前列腺癌病人血清中9種特異蛋白質(zhì)生物標(biāo)志,可將正常人、前列腺癌和良性前列腺肥大病人清楚的區(qū)分開(kāi)來(lái),而其敏感性和特異性均在90%左右[19]。

2•1•5胃癌:Xu等[20]分析不同病理分期胃癌和健康人的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜。進(jìn)一步鑒定一個(gè)1465u的蛋白質(zhì)指紋為端切纖維蛋白肽A(fibrin-opeptideA-degAla,FPA-degAla)。端切纖維蛋白肽A可作為最好的檢測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單個(gè)指標(biāo),雙盲驗(yàn)證在診斷胃癌的敏感性和特異性達(dá)到85•4%和100%。這些發(fā)現(xiàn)表明,凝血系統(tǒng)中纖維蛋白肽A減少或者纖維蛋白肽A的變異片段是胃癌生物學(xué)的早期事件。通過(guò)對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者和胃癌無(wú)淋巴結(jié)侵犯者血清中的端切纖維蛋白肽A進(jìn)行分析,可用于臨床胃癌輔助診斷、手術(shù)療效、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)及分期的判斷。其他腫瘤診斷:我國(guó)已有38個(gè)單位應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的臨床檢驗(yàn)和研究,均取得了與國(guó)際相似的結(jié)果[21~27]。美國(guó)NCI(NationalCancerInstitute)主席Dr.AndrewvonEschenbach在2005年4月16日(美國(guó)第96屆腫瘤年會(huì)上)宣布美國(guó)將用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對(duì)腫瘤早期定性和PET-CT對(duì)腫瘤早期定位相結(jié)合等手段對(duì)腫瘤作出極早期診斷,使腫瘤在2015年成為非致死性疾病。

2•2其他疾病的檢測(cè)

蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對(duì)其他疾病的檢測(cè)目前尚不普及,但一些研究報(bào)告的結(jié)果亦非常鼓舞人心。

2•2•1心血管疾病:蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在心血管疾病診斷方面也取得重大突破。首先,用SELDI-TOF-MS鑒定血清載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)和載脂蛋白A-Ⅱ(apoA-Ⅱ),解決了ELISA法的抗體交叉反應(yīng)問(wèn)題,這對(duì)糖尿病及心血管病的并發(fā)癥的監(jiān)控有重大意義[28]。其次,用SELDI-TOF-MS鑒定補(bǔ)體C3-α鏈及纖維蛋白原的早期降解蛋白質(zhì)指紋,能更早地發(fā)現(xiàn)心肌梗死[29]。第三,用SELDI技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C-Ⅰ(apoC-Ⅰ)和載脂蛋白C-Ⅲ(apoC-Ⅲ)可區(qū)別缺血性和出血性腦卒中[30]。

2•2•2感染性疾病:艾滋病是一種傳播越來(lái)越廣,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命的一種嚴(yán)重免疫缺陷病。在艾滋病感染的人群中,有2%~3%的人并不發(fā)病。自1986年以來(lái),經(jīng)過(guò)一系列的研究,認(rèn)為是被稱(chēng)之為“CAF”的抑制因子抑制了HIV-1的復(fù)制。但對(duì)其確切機(jī)制并不十分清楚[31]。2002年美國(guó)著名艾滋病專(zhuān)家、雞尾酒療法創(chuàng)始者何大一教授借助蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù),在短短三個(gè)月內(nèi)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在2%~3%艾滋病感染者而不發(fā)病的人群中,存在三個(gè)蛋白質(zhì)指紋,鑒定為α-defensin1、2和3抗艾滋病病毒的生物標(biāo)志[31]。這不僅極大推進(jìn)了艾滋病的發(fā)病機(jī)理及抗艾滋病機(jī)制的研究,也將推動(dòng)臨床艾滋病的防治進(jìn)展。對(duì)鼠疫和嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)的病原學(xué)診斷,特別是發(fā)病早期的檢測(cè)有時(shí)比較困難,通常主要依靠臨床和流行病調(diào)查進(jìn)行診斷。現(xiàn)在通過(guò)蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在發(fā)病早期即可進(jìn)行病原學(xué)診斷,研究已發(fā)現(xiàn)有五種生物標(biāo)志與鼠疫桿菌發(fā)病有關(guān)[32]。中國(guó)學(xué)者對(duì)早期SARS病人血清進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)病人在臨床發(fā)病早期(1~7d),即可檢測(cè)出相關(guān)的特異蛋白,其敏感性為98•6%,特異性為94•6%[33]。

2•2•3老年性癡呆癥:老年性癡呆癥是危害老年人身心健康的常見(jiàn)病,過(guò)去由于缺乏可靠的檢查方法及客觀診斷標(biāo)準(zhǔn),所以主要依靠病人的臨床表現(xiàn)加以診斷,而且一經(jīng)確診病人病情則已比較嚴(yán)重。一些研究曾發(fā)現(xiàn),一種β型淀粉樣多肽增高與該病發(fā)病有關(guān),但由于缺乏精細(xì)的檢測(cè)方法,對(duì)引發(fā)該病的多肽確切片段和分子質(zhì)量不甚清楚。因此,不能將其作為確診的標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)則能確定抗原變異片段,發(fā)現(xiàn)β型多肽中的片段1~42,分子質(zhì)量4514u是引發(fā)疾病的關(guān)鍵生物標(biāo)志。該生物標(biāo)志不僅可作為診斷的主要參考指標(biāo),還可為病人進(jìn)行早期診斷和早期治療提供依據(jù)[34]。

2•2•4慢性腎病:慢性腎病是臨床常見(jiàn)病,既往臨床上主要依靠腎小球?yàn)V過(guò)率及血清肌酐水平檢測(cè)進(jìn)行診斷及評(píng)價(jià)腎功能的受損程度。但這些檢測(cè)結(jié)果受許多因素的影響,如血液的稀釋度及其他非腎臟疾病的影響,均可能引起腎小球?yàn)V過(guò)率及肌酐水平的改變,因而并非慢性腎病所特異。然而,用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)已從慢性腎病病人中檢測(cè)到有一種分子質(zhì)量為26000u,鑒定為L(zhǎng)ipocalin型前列腺素D合成酶(L-PGDS)的糖蛋白,在慢性腎病時(shí)增高,對(duì)診斷有特殊意義[35]。

2•2•5移植檢測(cè):腎移植排斥反應(yīng)目前主要依靠腎活檢。但這種創(chuàng)傷性檢查有一定的危險(xiǎn)性和應(yīng)用的局限性?，F(xiàn)在,美國(guó)和加拿大科學(xué)家用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行尿液檢測(cè),可無(wú)創(chuàng)性、24h不間斷地監(jiān)測(cè)病情變化,鑒定急性腎移植排斥反應(yīng),其準(zhǔn)確率高達(dá)91%~94%。這對(duì)腎移植后免疫抑制劑用量的調(diào)整、并發(fā)癥與療效判斷有重大意義[36~37],也將對(duì)其他移植(肝、心)技術(shù)的精密組織配型、療效判斷、并發(fā)癥的研究提供重大參考價(jià)值。

3免疫組質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜與抗體分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為免疫組質(zhì)譜(Immunomicmassspectrometry,IMS)。免疫組質(zhì)譜檢測(cè)(Immunomicmassspectrometryanalysis,IMSA)為一組多種(類(lèi))抗體與質(zhì)譜聯(lián)合來(lái)精確地鑒別變異或修飾生物標(biāo)志群的方法。在一個(gè)抗體組基質(zhì)上同時(shí)捕獲多個(gè)生物標(biāo)志,并對(duì)捕獲的變異或修飾的生物標(biāo)志進(jìn)行質(zhì)譜精確分析?？梢酝瑫r(shí)檢測(cè)多個(gè)生物標(biāo)志群(biomarkers)。目前ELISA等技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測(cè)定法,因而無(wú)法直接鑒定抗原的變異,而用免疫組質(zhì)譜技術(shù)能測(cè)定抗原變異片段的分子質(zhì)量。另外,還可以將多種疾病的特異性抗原的抗體同時(shí)標(biāo)在一個(gè)基質(zhì)點(diǎn)上。即用質(zhì)譜同時(shí)可檢測(cè)多種疾病特異性抗原的分子質(zhì)量(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒),及進(jìn)行窗口期檢查,而ELISA技術(shù)及免疫熒光技術(shù)無(wú)法做到[34,38]。我國(guó)Xu等[39]首創(chuàng)用抗FPA(纖維蛋白肽A)、抗C3a(補(bǔ)體C3a)、抗ApoA-I(載脂蛋白A-I)、抗ApoA-II(載脂蛋白A-II)抗體組聯(lián)合標(biāo)記至磁珠上,通過(guò)分析正常人及消化系統(tǒng)腫瘤病人的血清蛋白質(zhì)指紋峰,發(fā)現(xiàn)1465u(纖維蛋白肽A其N(xiāo)端除去了丙氨酸)、8938u(補(bǔ)體C3a其C端除去了精氨酸)、28078u(載脂蛋白A-I)、8707u(載脂蛋白A-II)生物標(biāo)志可以用于區(qū)分正常人、消化系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志群變異表達(dá)。該檢測(cè)方法的靈敏度為:胃癌95%(198/208)、肝癌81%(183/226)、結(jié)直腸癌病人87%(158/182)。而消化系統(tǒng)腫瘤中胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌的AFP和CEA檢測(cè)靈敏度為:46%~60%。免疫組質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)對(duì)AFP和CEA表達(dá)陰性的胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌檢測(cè)陽(yáng)性,故免疫組質(zhì)譜技術(shù)特別對(duì)評(píng)估傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物陰性的惡性腫瘤有更大的意義。

由于每種特異性抗體所捕獲生物抗原的分子質(zhì)量是不同的,故免疫組與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用時(shí),質(zhì)譜儀就非常容易地將這四種抗原同時(shí)分開(kāi)了。用三種以上抗體組標(biāo)在磁珠上與質(zhì)譜聯(lián)合,可同時(shí)檢測(cè)出多種(三種以上)的生物標(biāo)志及一種或一種以上變異或修飾的生物標(biāo)志。這樣產(chǎn)生了一種新型可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析多種(三種以上)生物標(biāo)志及一種或一種以上變異或修飾生物標(biāo)志的方法。三色免疫熒光法可以同時(shí)分析三種生物標(biāo)志,但無(wú)法達(dá)到三種以上的生物標(biāo)志的分析或像免疫組質(zhì)譜檢測(cè)來(lái)精確地、高效地確定一種變異或修飾的被分析物(抗原或生物標(biāo)志)。這些生物標(biāo)志組合可以用于同時(shí)鑒別正常人及不同種類(lèi)疾病的檢測(cè)方法。目前用于臨床疾病治療療效監(jiān)測(cè)的方法和評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)多為宏觀和粗略的。如根據(jù)腫瘤包塊大小變化,陰影消失與否;血象和生化指標(biāo)的改變;根據(jù)骨髓中原始幼稚細(xì)胞的百分比作為判斷白血病緩解與否的指標(biāo);有時(shí)還采用的是回顧性分析指標(biāo)。因此,難以反映疾病本身本質(zhì)變化規(guī)律,在一定程度上缺乏客觀性。如果根據(jù)疾病生物標(biāo)志類(lèi)型和含量的改變,可能更符合客觀實(shí)際,更有助于臨床治療。

4蛋白質(zhì)指紋圖譜庫(kù)建立及標(biāo)準(zhǔn)化

目前,由于全世界實(shí)驗(yàn)室在質(zhì)控血清建立及儀器標(biāo)準(zhǔn)化狀態(tài)、儀器自動(dòng)化應(yīng)用方面存在不統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),故用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志進(jìn)行臨床診斷和治療干預(yù)之前,必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的多中心和三期臨床質(zhì)控驗(yàn)證。只有經(jīng)過(guò)如上所述的嚴(yán)格驗(yàn)證,才能將此技術(shù)用于疾病生物標(biāo)志的檢測(cè)與臨床診斷[10,40]。2004年,美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所(NCI)組織的早期疾病探測(cè)研究機(jī)構(gòu)(EDRN)多中心(6大機(jī)構(gòu))統(tǒng)一了血清及儀器標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控[10]。蛋白質(zhì)指紋圖譜儀也經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)[41]。中國(guó)的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn):供血者男女各半,血型為O型;年齡為18~30歲;民族,漢。生化指標(biāo)正常,包括:總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能檢查、腎功能檢查;無(wú)遺傳病家族史;無(wú)重大傳染病史。女性無(wú)懷孕,男性無(wú)吸煙史者。使用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為研究比較蛋白質(zhì)組學(xué)和發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記可選用的方法,尤其在多肽及低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)指紋圖譜分析的研究中非常有用[13,20~27]。但是,我們?cè)谶M(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)血液樣本離體后如不及時(shí)分離血清,對(duì)結(jié)果影響很大,因而及時(shí)分離血清成為實(shí)驗(yàn)的首要保障。分離血清的操作也比較簡(jiǎn)便可行。

第6篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

汽油中烴類(lèi)物質(zhì)的太赫茲時(shí)域光譜研究

利用太赫茲技術(shù)研究重油燃料油標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的微量硫含量

利用太赫茲技術(shù)研究煤炭中的灰分含量與碳含量

固化劑及其固化物的太赫茲光譜分析

吐溫與纖維相互作用的太赫茲波譜分析

沐浴露產(chǎn)品在THz波段的光譜特性

環(huán)氧樹(shù)脂及其混合物的太赫茲光譜分析

用太赫茲時(shí)域光譜定性鑒別十六烷值增進(jìn)劑的產(chǎn)品性能

基于S3C2440和Linux的溫濕度測(cè)控系統(tǒng)設(shè)計(jì)

離子遷移(IMS)漂移管的多物理場(chǎng)模擬方法研究

基于性能最優(yōu)的磁流變阻尼器勵(lì)磁線圈纏繞方法研究

基于嵌入式機(jī)器視覺(jué)技術(shù)的血型自動(dòng)識(shí)別系統(tǒng)

基于光纖陀螺的組合導(dǎo)航系統(tǒng)中雙DSP通信研究

級(jí)聯(lián)型多電平逆變器單元電路數(shù)字化控制的研究

小型便攜化SPR生物傳感系統(tǒng)的研制與應(yīng)用

基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)技術(shù)的BGA芯片精準(zhǔn)焊接定位的研究

大容量生物樣品快速灰化裝置研制及初步驗(yàn)證

嵌入式ARM在基于以太網(wǎng)的AUV控制系統(tǒng)中的應(yīng)用

力帆620汽車(chē)EPS系統(tǒng)故障自診斷研究

高可靠性礦用瓦斯爆炸防控系統(tǒng)

基于ANSYS的振動(dòng)盤(pán)給料器動(dòng)態(tài)分析

基于手持設(shè)備的煙塵濃度監(jiān)測(cè)軟件設(shè)計(jì)

溫室數(shù)據(jù)采集器誤差分析及校正

PDF軟件在質(zhì)量體系文件管理中應(yīng)用

自動(dòng)化立體倉(cāng)庫(kù)的應(yīng)用與物流發(fā)展的灰色關(guān)聯(lián)分析

一種PN碼快速捕獲的方法

法布里干涉近紅外光譜儀測(cè)定煙草品質(zhì)成分

應(yīng)用熒光光譜法檢測(cè)藍(lán)藻生物量

氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在水環(huán)境突發(fā)性污染事件中的應(yīng)用

頂空萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定一種兒童專(zhuān)用防痱止癢水的揮發(fā)性成分

土壤中全磷測(cè)定的不確定度評(píng)定

采用計(jì)算化學(xué)方法比較四種核苷的第一電離能

氣相色譜-質(zhì)譜法快速測(cè)定豬肉中的膽固醇

地物光譜儀在熱致變色材料表征中的應(yīng)用

氣相色譜法測(cè)定土壤中的6種酞酸酯

氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定全血中的五種酰胺類(lèi)除草劑

便攜式質(zhì)譜儀對(duì)某化工園區(qū)特征揮發(fā)性半揮發(fā)性有機(jī)物調(diào)查研究

離子色譜法測(cè)定葡萄酒中葡萄糖和果糖

HPLC及LC-MS技術(shù)在低聚糖檢測(cè)中的應(yīng)用

制氫方法及氫氣中微量雜質(zhì)的測(cè)定

綜合實(shí)驗(yàn)室成功實(shí)施LIMS的關(guān)鍵-量身定制

大型儀器管理人員工作交接的實(shí)踐與探討

動(dòng)態(tài)光散射激光粒度儀的特點(diǎn)及其應(yīng)用

TurboMatrix系列頂空進(jìn)樣器的維修及保養(yǎng)

UltraPyc系列真密度分析儀在稠油密度測(cè)試中的應(yīng)用

便攜式氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀的研制及應(yīng)用

AutoTDA自動(dòng)熱脫附解吸儀及其應(yīng)用

全自動(dòng)凱氏定氮儀簡(jiǎn)介

環(huán)保部:公眾支持PM2.5納入空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中微子超光速實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲“確認(rèn)”質(zhì)疑仍存

靈敏度升十倍廉價(jià)石墨烯傳感器問(wèn)世

科學(xué)家研制出萬(wàn)能流感疫苗無(wú)需每年接種

我國(guó)工業(yè)排放氣制乙二醇技術(shù)獲突破

《現(xiàn)代科學(xué)儀器》征稿啟事

《現(xiàn)代科學(xué)儀器》關(guān)于論文中英文摘要的寫(xiě)作要求

關(guān)于召開(kāi)2012北京教育裝備展示會(huì)的通知

2011年《現(xiàn)代科學(xué)儀器》1～6期總目錄

復(fù)雜裝置環(huán)境側(cè)裝裝校系統(tǒng)碰撞檢測(cè)

第7篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全；檢測(cè)技術(shù)

目前我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)正處于由量變到質(zhì)變轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)型期。農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全已成為影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要問(wèn)題。建立農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)體系可以發(fā)揮重要的作用。農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)體系由農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)技術(shù)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全追溯技術(shù)組成。其中，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)技術(shù)是評(píng)價(jià)農(nóng)產(chǎn)品安全的重要依據(jù)。

一、無(wú)損檢測(cè)技術(shù)（NDT）

利用農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)部結(jié)構(gòu)異?；蛉毕荽嬖谒鸬膶?duì)熱、聲、光、電、磁等反應(yīng)的變化，來(lái)探測(cè)各種農(nóng)產(chǎn)品的缺陷。并對(duì)缺陷的類(lèi)型、性質(zhì)、數(shù)量、形狀、位置、尺寸、分布及其變化做出評(píng)價(jià)。

二、食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)

1.農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù)

（1）化學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)：該技術(shù)主要用于果蔬中有機(jī)磷的檢測(cè)，利用有機(jī)磷農(nóng)藥在金屬催化劑作用下水解為磷酸與醇，水解產(chǎn)物與檢測(cè)液反應(yīng)，檢測(cè)液的紫紅色褪去成無(wú)色，如“速測(cè)靈”。

（2） 酶抑制技術(shù)：根據(jù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶的特異性生化反應(yīng)建立起來(lái)的農(nóng)藥殘留的微量與痕量快速檢測(cè)技術(shù)。

（3）免疫技術(shù)：有些發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)、德國(guó)等已開(kāi)發(fā)出有機(jī)磷類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)、硫代氨基甲酸酯類(lèi)、有機(jī)氯類(lèi)、三嗪類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)和酰胺類(lèi)等幾十種農(nóng)藥的酶免疫商品檢測(cè)試劑盒應(yīng)用。

2.獸藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù)。主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫方法、膠體金試紙條和蛋白芯片。幾種方法中ELISA 方法為定量方法，其利用標(biāo)記物的酶催化底物顯色反應(yīng)來(lái)反映抗原抗體的結(jié)合過(guò)程，將酶催化底物的靈敏性與抗原抗體的特異性相結(jié)合。

放射免疫檢測(cè)法是采用同位素標(biāo)記技術(shù)來(lái)檢測(cè)抗原抗體的高靈敏度方法，其最成功的是美國(guó)CHARM Science公司Charm6600/7600 抗生素快速檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用專(zhuān)一性受體來(lái)識(shí)別同一類(lèi)抗生素中的母環(huán)，并以最快速度檢測(cè)同一抗生素族在樣品中的殘留情況。

試紙條方法因靈敏度低，特異性差，僅適合殘留限量要求不高的少數(shù)藥物的粗篩。蛋白芯片可用于多殘留檢測(cè)，但是靈敏度需進(jìn)一步提高。

3.光譜分析儀器。光譜分析儀器主要是對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中重金屬元素含量進(jìn)行分析檢測(cè)。已研制出的氣相色譜-原子吸收光譜（GC-AAS）聯(lián)用儀器，進(jìn)一步拓展了原子吸收光譜法的應(yīng)用領(lǐng)域。

三、色譜及質(zhì)譜分析儀器

1.氣相色譜法（GC）。目前約80%的農(nóng)藥可用氣相進(jìn)行分析，如農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、氨基酸等。ECD檢測(cè)器測(cè)定含氯化合物；TSD檢測(cè)器測(cè)定含硫、磷化合物；PFPD檢測(cè)器測(cè)定含硫、磷、氮、鉛、砷、錫等有機(jī)化合物。

二維氣相色譜（GC-GC）分析技術(shù)，利用兩根極性不同的色譜柱，待混合物在第一根色譜柱上預(yù)分離后，將需要進(jìn)一步分離的待測(cè)組分轉(zhuǎn)移到第二根色譜柱進(jìn)行更有效的分離?？梢蕴岣咿r(nóng)產(chǎn)品復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留分析的能力有重要意義。

2.高效液相色譜法（HPLC）。世界上幾百萬(wàn)種化合物有80%可用HPLC進(jìn)行分析。其在農(nóng)產(chǎn)品的污染物、營(yíng)養(yǎng)成分、添加劑、毒素、保健品的有效成分、核酸、農(nóng)獸藥殘留等檢測(cè)方面得到充分應(yīng)用。借助于傳統(tǒng)HPLC理論及原理，涵蓋小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，出現(xiàn)了超高效液相色譜（UPLC）。

3.色譜-質(zhì)譜分析法。質(zhì)譜儀（MS）在農(nóng)產(chǎn)品安全分析中能夠定性或定量地檢測(cè)出其中揮發(fā)性成分、糖類(lèi)組成、氨基酸（蛋白質(zhì)）、香味成分及有毒有害物質(zhì)等成分。

（1）氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS或GC-MS-MS）。GC-MS法不僅依據(jù)樣品中待測(cè)組分在圖譜上的保留時(shí)間，更主要是依據(jù)在此保留時(shí)間內(nèi)殘留農(nóng)藥裂解的特征離子碎片，由質(zhì)譜儀按其分子量和分子結(jié)構(gòu)對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行準(zhǔn)確定性，并以此為定量依據(jù)，從而克服因未凈化掉的雜質(zhì)峰與農(nóng)藥保留時(shí)間重疊而造成的將雜質(zhì)峰誤判為農(nóng)藥的缺點(diǎn)。

（2）液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS或LC-MS-MS）。獸藥多殘留分析以LC-MS-MS分析為主。它能有效地測(cè)定待測(cè)物中的痕量組分，能很好分析非揮發(fā)性農(nóng)藥殘留物、糖類(lèi)等物質(zhì)。同時(shí)使用LC-MS-MS可克服背景干攏，通過(guò)MS-MS的選擇反應(yīng)控制模式（SRM）或多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM），提高信噪比，故對(duì)復(fù)雜樣品可達(dá)到很高的靈敏度。

（3） UPLC-MS-MS技術(shù)。UPLC與質(zhì)譜聯(lián)用不僅獲得高速、高分離度，而且顯著地提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度。UPLC-MS-MS可在更短的時(shí)間內(nèi)、以更高分離度獲得更高靈敏度的、更高置信度的檢測(cè)結(jié)果。τ謔稱(chēng)泛團(tuán)┎品中氯霉素、硝基呋喃及其代謝產(chǎn)物、蘇丹紅、孔雀石綠、丙烯酰胺、D-內(nèi)酰胺、氟喹諾酮等多種藥物殘留和農(nóng)藥殘留及其代謝產(chǎn)物等的分析，UPLC-MS-MS皆可體現(xiàn)其快速、靈敏的明顯技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

四、前處理

由于農(nóng)產(chǎn)品基體復(fù)雜，有害污染物含量極其微量，同時(shí)各種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)待測(cè)物最大殘留的檢出限提出了更嚴(yán)格的要求，而我國(guó)傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)已成為瓶頸，故一些前處理新技術(shù)相繼出現(xiàn)并很快得到推廣，如固相萃取技術(shù)（SPE），固相微萃取（SPME），基質(zhì)固相分散萃?。∕SPDE）， 超臨界流體萃?。⊿FE），凝膠滲析萃?。℅PC）。

最新的PrepLinc Platform樣品前處理平臺(tái)系統(tǒng)，融合了GPC樣品凈化技術(shù)、SPE固相萃取技術(shù)和全自動(dòng)定量濃縮技術(shù)，并將其有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，使樣品可按預(yù)設(shè)的程序自動(dòng)完成GPC樣品凈化，SPE凈化及濃縮、定容及溶劑轉(zhuǎn)換功能。此外微波萃取、微孔液膜萃取、納米富集材料等新技術(shù)及全自動(dòng)加溫加壓快速溶劑萃取等，都將在未來(lái)農(nóng)產(chǎn)品、食品安全的檢測(cè)中發(fā)揮作用。

五、結(jié)論與展望

由于航天科技、生命科學(xué)、軍事、反恐和環(huán)保等領(lǐng)域的迫切需求，近幾年來(lái)儀器微型化、全微分析、芯片技術(shù)等發(fā)展極快，出現(xiàn)了鞋盒大小的微型質(zhì)譜、微型色譜、芯片毛細(xì)管電泳儀、陣列傳感器和生物芯片。新儀器、新方法的不斷開(kāi)發(fā)，必將使這些新技術(shù)延伸和擴(kuò)散到食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，催生出新一代方法和儀器，既具有大型分析儀器的靈敏度、檢出限，又便于使用和攜帶。

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第8篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

【關(guān)鍵詞】電感耦合；離子體質(zhì)譜法；金屬元素

金屬元素是人體必不可少的重要組成成分，但是部分金屬元素超過(guò)一定濃度時(shí)，可引起中毒。職業(yè)人群生物樣品檢驗(yàn)?zāi)軌蜉^為準(zhǔn)確地提供勞動(dòng)者的實(shí)際接觸水平，有毒物質(zhì)的增高說(shuō)明體內(nèi)的過(guò)度吸收，尿中元素的生物學(xué)水平是反映環(huán)境質(zhì)量和職業(yè)接觸的重要指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)分析方法多采用傳統(tǒng)的原子吸收，原子熒光，分光光度法等檢測(cè)方法，以上方法操作復(fù)雜，試劑繁多，需要逐一單項(xiàng)檢測(cè)。本文使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法快速測(cè)定尿中釩、鉻、鈷、砷、鎘、鉛、鉈。該方法可同時(shí)測(cè)定多種元素，具有靈敏度高、檢出限低的優(yōu)點(diǎn)。

一、材料與方法

1.儀器與試劑

1.1儀器

（1）電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent 7700X ICP-MS，碰撞/反應(yīng)池，自動(dòng)進(jìn)樣器，耐高鹽霧化器，鎳采樣錐和截取錐；

（2）超純水處理系統(tǒng) 美國(guó)Milli-Q，MILLIPORE公司。

1.2試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液

濃硝酸：68%（V/V），優(yōu)級(jí)純；單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液：釩、鉻、鈷、砷、鎘、鉛、鉈（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)物質(zhì)研究中心）；內(nèi)標(biāo)溶液：用1.0%HNO3將釔（Y）、銦（In）、鈥（Ho）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成1.0mg/L的混合內(nèi)標(biāo)貯備液。

1.3儀器操作條件：射頻功率：1450kW；采樣深度：8.0mm；等離子體氣：15.0L/min；炬管水平位置：-0.5mm；輔助氣：0.25L/min；炬管垂直位置：-0.0mm；載氣：0.85L/min；掃描模式：Fullquant；積分時(shí)間：0.10s（AsHg為0.2s）；采集次數(shù)：3；提取透鏡1：2.0V；提取透鏡2 ：-105.0V。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

準(zhǔn)確量取釩（V）、鉻（Cr）、鈷（Co）、砷（As）、鎘（Cd）、鉈（TL）、鉛（Pb）的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.0mL、0.010mL、0.050mL、0.10mL、0.50mL、1.0mL置100mL容量瓶，用1% HNO3定容至刻度，配制成0.0?g/L、0.10?g/L、0.50?g/L、1.0?g/L、5.0?g/L、10.0?g/L標(biāo)準(zhǔn)曲線；用1.0%HNO3將內(nèi)標(biāo)溶液稀釋成10.0?g/L的應(yīng)用液。

1.5樣品制備

用1%硝酸把尿樣稀釋20倍，直接進(jìn)樣。

二、結(jié)果與討論

2.1前處理方法的選擇

取一份混合尿樣50mL，加入10.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.10mL，配制7種待測(cè)元素加標(biāo)濃度為20.0?g/L的尿樣，分別采用三種前處理方法進(jìn)行測(cè)定：

方法1：用1.0%HNO3將尿樣稀釋20倍后測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線以1.0%HNO3為介質(zhì)；

方法2：用1.0%HNO3將尿樣稀釋10倍后測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線以1.0%HNO3為介質(zhì)；

方法3：用0.5%NH3H2O將尿樣稀釋20倍后測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線以0.5%NH3H2O為介質(zhì)；

結(jié)果表明，方法3的整體精密度較差，可能是因?yàn)橛行┰嘏c氨水形成的絡(luò)合物較難電離；方法2的尿砷回收率偏高，可能是因?yàn)槟驑拥幕w效應(yīng)使As的信號(hào)增強(qiáng)，而方法1前處理效果最好，因?yàn)槟驑酉♂尡稊?shù)加大后，基體效應(yīng)減小，同時(shí)尿樣中的Cl 含量降低，40Ar35Cl對(duì)砷的干擾也減少，其各項(xiàng)性能指標(biāo)均能滿足規(guī)范要求，因此我們選用方法1作為前處理方法。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢出濃度

ICP-MS具有7個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍，因此實(shí)際應(yīng)用時(shí)可根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行調(diào)整。本方法的線性范圍是結(jié)合待測(cè)元素的生物限值和本底值配制，各元素線性的相關(guān)系數(shù)和線性范圍如表2所示；將儀器調(diào)至最佳狀態(tài)，以研制的測(cè)定方法連續(xù)測(cè)定11次空白溶液，由測(cè)量值計(jì)算其濃度平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以標(biāo)準(zhǔn)差法計(jì)算各元素的檢出限（3SD）和定量限（10SD），以尿樣稀釋20倍計(jì)算其最低檢出濃度

2.3 精密度

將混合尿分成 4 組，每組100ml，其中 1 組為本底尿，其他 3 組分別加入鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0mg/L ）0.25mL、0.50mL、1.0mL，加入鉛標(biāo)準(zhǔn)液（10.0mg/L ）0.20mL、0.50mL、1.0mL，加入釩、鉻、鈷、砷、鉈混合標(biāo)準(zhǔn)液（10.0mg/L ）0.10mL、0.20mL、0.50mL，配制成鎘的加標(biāo)濃度為2.5?g/L、5.0?g/L、10.0?g/L，鉛加標(biāo)濃度為20.0?g/L、50.0?g/L、100?g/L，其他待測(cè)元素加標(biāo)濃度為10.0?g/L、20.0?g/L、50.0?g/L的低、中、高濃度尿樣；將上述加標(biāo)尿樣在配制當(dāng)天進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，作為批內(nèi)精密度，結(jié)果在1.69%～8.97%，3天內(nèi)進(jìn)行6次測(cè)定，作為批間精密度，結(jié)果在1.69%～8.97%，如見(jiàn)下表3、表4。

2.4 準(zhǔn)確度

分別測(cè)定待測(cè)元素配制成低、中、高濃度的尿樣，每組濃度測(cè)定3次，取平均值，減去空白本底后，分別計(jì)算每個(gè)元素的加標(biāo)回收率在86.2%～105%，如表6所示。

用電感耦合等離子體質(zhì)譜法快速測(cè)定尿中釩、鉻、鈷、砷、鎘、鉛、鉈元素，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、覆蓋元素種類(lèi)多，合適人尿中微量元素的測(cè)定。采用1%硝酸稀釋尿樣直接進(jìn)樣，簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，與碰撞池ICPMS技術(shù)結(jié)合，適用于尿樣中多種微量元素的快速測(cè)定。

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第9篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞:SELDI-TOF-MS;蛋白質(zhì)組學(xué);診斷

中圖分類(lèi)號(hào):R2-03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1673-7717(2010)01-0051-03

Application of SELDI-TOF-MS in Clinical Diagnosis

LIU Chibo,LIANG Yong,CHEN Jinguang,PAN Chunqin,YAN Dongliang,WANG Haibao,ZHOU Kaiyu

(Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000,Zhejiang,China)

Abstract:The technique of surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) provides the most effective platform for research of proteomics. SELDI-TOF-MS, which combine the technologies of proteinchip with time of flight-mass spectra and integrate separation, purification, analysis of sample and realize rapid, high performance and high throughput detection, is an extremely important tool for diagnosis of disease at the molecular level.

Key words:SELDI-TOF-MS; proteomics; diagnosis

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)技術(shù)是后基因組時(shí)代的一重要研究工具,在生命科學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)組學(xué)是通過(guò)對(duì)不同時(shí)間和空間發(fā)揮特定功能的蛋白質(zhì)群體進(jìn)行研究,闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能模式,包括鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)、存在方式(修飾形式)、結(jié)構(gòu)、功能及相互作用方式等,從機(jī)體或細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體活動(dòng)來(lái)揭示生命規(guī)律。而SELID蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。嚴(yán)格來(lái)說(shuō),SELDI技術(shù)是一種“比較”技術(shù),也是在現(xiàn)有蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中唯一在檢測(cè)樣本數(shù)量和每個(gè)樣本中蛋白質(zhì)數(shù)量?jī)煞矫孢_(dá)到高通量的技術(shù)。在過(guò)去幾年中,隨著儀器性能和相關(guān)技術(shù)方法的改進(jìn)和探索,應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)腫瘤標(biāo)志蛋白的研究獲得廣泛和迅猛發(fā)展。2004年以來(lái),該技術(shù)在美國(guó)已被列入人類(lèi)蛋白質(zhì)組計(jì)劃主要推薦技術(shù)之一。我國(guó)已有20余個(gè)單位開(kāi)展此項(xiàng)研究。以下對(duì)SELDI質(zhì)譜技術(shù)的基本原理、優(yōu)點(diǎn)及在臨床診斷中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 SELDI-TOF-MS原理

SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合了蛋白芯片和生物質(zhì)譜技術(shù),是繼基因芯片之后出現(xiàn)的新一代生物芯片技術(shù)。該芯片設(shè)計(jì)的基本原理是:首先用生物或化學(xué)方法在載體表面制成點(diǎn)狀芯池,再點(diǎn)入待檢的生物樣品,其中的蛋白分子通過(guò)其自身的生物或理化性質(zhì)(親水性、疏水性、金屬絡(luò)合及離子作用等)與芯片相結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)捕獲、保留和純化與之特異性結(jié)合的蛋白分子。接著用緩沖液洗脫未結(jié)合或非特異性結(jié)合的分子后再用激光脈沖進(jìn)行轟擊,即釋放出靶點(diǎn)上的特異性蛋白分子。不同質(zhì)荷比(m/z)的離子在電場(chǎng)中飛行的時(shí)間長(zhǎng)短不一,分子量越大的離子在電場(chǎng)中飛行的時(shí)間越長(zhǎng),反之則越短。最后通過(guò)生物質(zhì)譜(TOF-MS)即可繪制出一張質(zhì)譜圖。該圖經(jīng)分析軟件處理后還可形成模擬譜圖,用于更直觀地顯示樣品中各種蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、含量及磷酸化位點(diǎn)等信息。蛋白質(zhì)芯片根據(jù)表面物質(zhì)的不同,可將其劃分為化學(xué)型和生物型兩類(lèi)?；瘜W(xué)型芯片通過(guò)化學(xué)作用結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì),并根據(jù)其作用原理的不同又可進(jìn)一步細(xì)分為疏水性芯片、親水性芯片、陽(yáng)離子芯片、陰離子芯片和金屬親和芯片等類(lèi)型;生物型芯片則是把生物活性分子,如抗體、酶、受體、DNA等結(jié)合到芯片表面,借助抗原-抗體、酶-底物、受體-配體、蛋白質(zhì)-DNA等相互作用結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì)。生物芯片特異性高,還可以進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

2 SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

相比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組技術(shù),如二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)、電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF-MS)技術(shù),SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于:①可分析2D-PAGE無(wú)法分析的蛋白質(zhì),包括疏水性蛋白質(zhì),低分子量(

3 SELDI-TOF-MS技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用

3.1 在腫瘤特異性標(biāo)志物的篩選中的應(yīng)用

3.1.1乳腺癌 Li等[1]用SELDI-TOF-MS技術(shù)及配套蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)49例乳腺癌和37例非乳腺癌疾病患者的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜,并運(yùn)用SPSS 10.0軟件判別分析處理數(shù)據(jù)和篩選標(biāo)志物,建立了3個(gè)診斷模型。組合構(gòu)建的診斷模型Ⅰ包括6個(gè)蛋白質(zhì)峰,質(zhì)荷比分別為8611、16827、25711、28931、25485和2437,鑒別乳腺癌和非乳腺癌疾病的敏感性為81.6%,特異性為78.4%。組合的診斷模型Ⅱ也包括6個(gè)蛋白質(zhì)峰,其質(zhì)荷比分別為4470、10854、19193、3883、2011和7470,鑒別Ⅰ期乳腺癌與非乳腺癌疾病的敏感性為80.0%,特異性為89.2%。組合的診斷模型Ⅲ包括5個(gè)蛋白質(zhì)峰,其質(zhì)荷比分別為2726、27014、2247、4477和19333,鑒別Ⅰ期與Ⅱ～Ⅳ期乳腺癌的敏感性為91.2%,特異性為93.3%。Ricolleaun[2]等采用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析了30例非結(jié)節(jié)性無(wú)再發(fā)乳腺癌患者和30例發(fā)生轉(zhuǎn)移性再發(fā)患者的病理標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)多達(dá)72個(gè)峰,其中兩個(gè)被證明是泛肽和鐵蛋白輕鏈(FLC)。進(jìn)一步研究表明,細(xì)胞溶質(zhì)的泛肽水平增高和(或)FLC的水平下降可以很好地預(yù)示乳腺癌。

3.1.2胃癌 Liang等[3]在胃癌方面檢測(cè)了33例胃腺癌患者和31例健康者的血清蛋白質(zhì)組,建立了質(zhì)荷比分別為5910、5084、6640和8691的差異蛋白峰的胃癌特征性蛋白質(zhì)波譜模型,用該模型檢測(cè)的靈敏度為90.91%(30/33),特異性為93.55%(29/31),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.75%(30/32)。Melle等[4]對(duì)74份包括胃癌組織、癌旁組織及正常胃上皮的冰凍切片進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在癌組織中明顯下調(diào)的蛋白,免疫組化鑒定為胃蛋白酶(原)C(pepsinogen c)。高春芳等[5]研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者與正常人在質(zhì)荷比為1723～14048間有18種血清蛋白質(zhì)含量有顯著差異,其中質(zhì)荷比為2786、2878、3170、13872、5257的5種蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將正常人與胃癌患者準(zhǔn)確地分組,其敏感性與特異性均高于用CEA診斷胃癌。Qian等[6]利用 SELDI-TOF-MS技術(shù)及生物標(biāo)記軟件(BPS)發(fā)現(xiàn)了血清中16個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰,其中9個(gè)峰在胃癌患者中高表達(dá)。經(jīng)過(guò)BPS分析,其中兩個(gè)峰組成的腫瘤標(biāo)記物模型在診斷的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性均高于目前臨床上的血清標(biāo)記物CEA、CA19-9和 CA72-4,尤其研究中的所有I/II期胃癌患者均被正確識(shí)別,但該診斷模型的臨床意義仍需大規(guī)模的研究來(lái)驗(yàn)證。劉池波等[7]利用SELDI技術(shù)發(fā)現(xiàn)胃癌患者中一簇質(zhì)荷比在11.1～11.9KD的蛋白峰明顯高于健康者,經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定該簇蛋白為血清淀粉樣蛋白A,可用于胃癌患者的早期診斷、療效觀察。

3.1.3 前列腺癌 Pant等[8]使用SELDI-TOF-MS技術(shù)。對(duì)83例前列腺癌 (PCA)患者和95例健康人血清標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)比較。在PCA患者血清中有4種蛋白表達(dá)水平升高,8種蛋白表達(dá)水平降低,出現(xiàn)了18個(gè)潛在的生物標(biāo)記。選擇其中8個(gè)蛋白標(biāo)記通過(guò)建立的五層決策樹(shù)分類(lèi)系統(tǒng)鑒別診斷PCA和健康人,特異性為92.6%,敏感性為96.4%。Adamt等[9]為了尋找PCA特異蛋白標(biāo)記物,設(shè)定了3組研究對(duì)象(PCA患者167例,良性前列腺增生患者77例,年齡匹配健康男性82例),使用SELDI-TOF-MS進(jìn)行血清檢測(cè),在PCA患者中發(fā)現(xiàn)9個(gè)蛋白質(zhì)峰與正常人及前列腺增生患者不同。以檢測(cè)到的9個(gè)蛋白質(zhì)峰為分析依據(jù),結(jié)果腫瘤組檢測(cè)敏感性為83%,對(duì)照組特異性為97%,對(duì)試驗(yàn)組的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96%,合并試驗(yàn)組分析(PCA和非癌組)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為9l%。研究者認(rèn)為,SELDI-TOF-MS和五層決策樹(shù)分類(lèi)系統(tǒng)對(duì)于PCA的早期診斷是一種高準(zhǔn)確性和創(chuàng)新性的方法。

3.1.4肝癌 Wang[10]等將106份血清樣本(包括52例肝細(xì)胞癌患者、22例肝硬化患者和32例健康志愿受試者血清)隨機(jī)分成兩組。訓(xùn)練組包括35例肝細(xì)胞癌患者、14例肝硬化患者和。21例健康受試者血清,用以建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)模型;試驗(yàn)組包括17例肝細(xì)胞癌患者、8例肝硬化患者和11例健康受試者血清。采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)訓(xùn)練組56例樣本(35例肝細(xì)胞癌患者、21例健康受試者血清)分析后獲得241個(gè)蛋白質(zhì)峰,其中21個(gè)峰用于肝細(xì)胞癌和正常對(duì)照比較(P

3.2在男性不育相關(guān)領(lǐng)域疾病研究方面的應(yīng)用

楊歡等[11]利用H4、SAX2等芯片鑒定出幾個(gè)在少精癥患者異的生物標(biāo)志物,如在H4芯片上,少精癥患者精漿與生育男性精漿蛋白質(zhì)圖譜比較,有1處蛋白質(zhì)峰明顯增高,其相對(duì)分子質(zhì)量為11507.4,有1處蛋白質(zhì)峰明顯降低,其相對(duì)分子質(zhì)量為11022.9,在SAX2蛋白質(zhì)芯片上,少精癥患者精漿與生育男性精漿蛋白質(zhì)圖譜相比有1處蛋白質(zhì)峰明顯增高,其相對(duì)分子質(zhì)量為16751.6。由此,可根據(jù)患者精漿中的差異蛋白含量可來(lái)幫助鑒定是否患有少癥。白潔等[12]利用CM10芯片通過(guò)無(wú)癥組與正常組比較有28種蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異,差異的蛋白質(zhì)中有24種含量低于正常組,其中4個(gè)M/Z在7 196.058、7 630.573、7 547.610和7 709.833的蛋白質(zhì)差異極顯著(P

3.3在膝骨性關(guān)節(jié)炎不同中醫(yī)證型領(lǐng)域研究中的應(yīng)用

王海寶[13]應(yīng)用CM10蛋白芯片分析了30例肝腎虧虛型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者、35例氣滯血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血清和40例健康著血清的蛋白指紋圖譜,獲得的蛋白質(zhì)譜采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝腎虧虛型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者與健康者血清蛋白質(zhì)譜相比有18個(gè)顯著差異蛋白質(zhì)(P

4展 望

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近年來(lái)興起的的一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新方法,以質(zhì)譜分析替代傳統(tǒng)的免疫診斷也是一種新出現(xiàn)的疾病診斷模式,以SELDI質(zhì)譜蛋白質(zhì)芯片技術(shù)為尋找疾病標(biāo)志物建立了一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái),其快速、高通量、準(zhǔn)確的特點(diǎn)已經(jīng)被廣泛的認(rèn)同。隨著這項(xiàng)技術(shù)逐漸推向臨床,也發(fā)現(xiàn)這項(xiàng)技術(shù)尚待完善,如差異蛋白的在線鑒定問(wèn)題;如圖譜中的峰高和蛋白質(zhì)濃度之間的關(guān)系并非都是線性的;不同的研究者,由于檢測(cè)過(guò)程中諸多因素的控制不一,對(duì)同種疾病得到的具有區(qū)分作用的峰是有差異的。所以 SELDI-TOF-MS要全面應(yīng)用于臨床研究,還需要在標(biāo)準(zhǔn)化、定性等問(wèn)題上深入研究,在今后的實(shí)踐過(guò)程中還有很多的問(wèn)題需要解決,但SELDI-TOF-MS技術(shù)必將成為快速診斷、發(fā)現(xiàn)并鑒定腫瘤標(biāo)志物的有效手段。

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