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【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇;微小RNA-146a;肺泡巨噬細(xì)胞;腫瘤壞死因子-α
Effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide-induced micRoRNA-146a in alveolaR macRophages Zeng Zhenguo,Shao Qiang,Li Yong,Ding Chengzhi, Qing Cheng, Liu Fen, Zhan Yian, Nie Cheng, Jie Kemin, Gong Honghan, Qian Kejian. DepaRtment of CRitical CaRe Medicine, FiRst Affiliated Hospital, Medical College of Nanchang UniveRsity, Nanchang 330006, China
CoRResponding authoR: Qian Kejian,Email:qkj0607@sohu,com
【AbstRact】Objective To obseRve the effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide (LPS) -induced micRoRNA-146a (miR-146a) in alveolaR macRophages. Methods Rat alveolaR macRophages(NR8383)weRe seeded at 2×106cell/poRe in 6 well plates in vitRo and incubated foR 90 min. NR8383 weRe Randomly divided into fouR gRoups: contRol gRoup, NR8383 stimulated with phosphate buffeR solution (PBS); LPS-stimulated gRoup, NR8383 stimulated with 1μg/mL of LPS; ResveRatRol-tReated gRoup, NR8383 tReated with diffeRent concentRations of ResveRatRol (1 μg/mL oR 10 μg/mL) foR 30 min, then stimulated with 1 μg/mL of LPS. AfteR incubation foR 6 h, the cells weRe haRvested and the supeRnatant of cell cultuRe medium was collected. The expRession of miR-146a of cells was detected by using fluoRoilluminance Real-time quantitative PCR device, and the levels of TNF-α pRotein in the supeRnatant weRe assayed by using enzyme-linked immunosoRbent assay (ELISA).Results CompaRed with contRol gRoup, the expRession of miR-146a and the level of TNF-α weRe significantly incReased in LPS stimulated gRoup (miR-146a’ s expRession folds: 5,92±1,57 vs 1,03±0,58,P
【Key woRds】ResveRatRol; MicRoRNA-146a; AlveolaR macRophages; TumoR necRosis factoR-α
大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明,白藜蘆醇對(duì)膿毒癥肺損傷具有保護(hù)作用[1-5]。微小RNA-146a(miR-146a)是TLRs/NF-κB炎癥通路中重要的負(fù)反饋調(diào)控介質(zhì),能夠抑制炎癥反應(yīng)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),miR-146a參與了肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng),有望成為抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的新途徑[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇與miRNA關(guān)系密切,有可能通過miRNA發(fā)揮其抗炎作用[9-11]。然而,在肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中,白藜蘆醇是否影響miR-146a的表達(dá)以及是否通過上調(diào)miR-146a的表達(dá)來抑制炎癥介質(zhì)釋放均未見報(bào)道。
1 材料與方法
1,1 實(shí)驗(yàn)材料
大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383(中國科學(xué)院細(xì)胞庫),胎牛血清(美國HyClone),Ham’ s F-12K培養(yǎng)基(美國Sigma-AldRich),LPS(E,coli 0111∶ B4,美國Sigma-AldRich),白藜蘆醇(美國Enzo life sciences),TRIzol Reagent(美國InvitRogen),四甲基偶氮唑鹽(MTT,北京索來寶科技有限公司),TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)試劑盒、TaqMan MicRoRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan MicRoRNA 檢測(cè)試劑盒(美國ABI),十二烷基硫酸鈉(SDS,美國Sigma-AldRich),大鼠TNF-α ELISA試劑盒(上海明睿生物),氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。
1,2 細(xì)胞培養(yǎng)
R8383細(xì)胞培養(yǎng)于含15%FBS、1,5 g/L碳酸氫鈉、2 mmol L-谷氨酰胺的Ham’ s F-12K完全培養(yǎng)基中,置于大氣壓下37 ℃、含5%體積分?jǐn)?shù)CO2的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d更換培養(yǎng)液,3~4 d傳代1次。
1,3 MTT比色法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活性的影響
取指數(shù)生長(zhǎng)期NR8383細(xì)胞,按每孔細(xì)胞0,5×104個(gè)接種至96孔板。細(xì)胞貼壁90 min后,分別加入0,1、1、10、50、100 μg/mL終質(zhì)量濃度的白藜蘆醇,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(等體積PBS替代白藜蘆醇)和陽性對(duì)照組(等體積10%二甲亞砜替代白藜蘆醇)。加藥后細(xì)胞再培養(yǎng)48 h,加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入三聯(lián)溶解液100 μL/孔,于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育8 h,用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)570 nm)測(cè)定各孔的吸光度(OD 570 nm)值。
1,4 細(xì)胞處理及分組
取指數(shù)生長(zhǎng)期NR8383細(xì)胞,按每孔細(xì)胞2×106個(gè)接種至6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)90 min后,分為以下四組:(1) LPS處理組:培養(yǎng)板中加入LPS溶液(終質(zhì)量濃度1 μg/mL);(2) PBS對(duì)照組:培養(yǎng)板中加入等體積PBS溶液;(3) 白藜蘆醇+LPS組:培養(yǎng)板中加入不同濃度白藜蘆醇溶液(終質(zhì)量濃度1 μg/mL、10 μg/mL)預(yù)處理30 min后,加入LPS溶液(終質(zhì)量濃度1 μg/mL)。細(xì)胞培養(yǎng)6 h后,離心收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞團(tuán)塊,保存于-80 ℃冰箱,分別用于ELISA檢測(cè)和細(xì)胞總RNA提取。
1,5 檢測(cè)指標(biāo)及方法
1,5,1 TNF-α蛋白測(cè)定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,檢測(cè)按照ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測(cè)。
1,5,2 miR-146a表達(dá)測(cè)定 采用TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性及純度,紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。采用TaqMan MicRoRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件:16 ℃ 30 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min。采用TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95 ℃ 10 Rain;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個(gè)擴(kuò)增循環(huán),在ABI 7500定量PCR儀上擴(kuò)增和檢測(cè)。操作均按說明書進(jìn)行,所有操作均在冰上完成。選取U6 snRNA作為內(nèi)參照,miR-146a的相對(duì)表達(dá)量采用2-Ct計(jì)算。
1,6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 13,0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P
2 結(jié)果
2,1 MTT比色法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)NR8383
細(xì)胞活性的影響
白藜蘆醇在0,1~100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)NR8383細(xì)胞無毒性作用。見圖1。
2,2 TNF-α蛋白含量及細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)變化
表1顯示,與PBS對(duì)照組相比,LPS處理組TNF-α蛋白含量及miR-146a表達(dá)均明顯升高(P
3 討論
膿毒癥并發(fā)急性肺損傷是膿毒癥高病死率的主要原因[12,13],如果發(fā)生膿毒癥時(shí)避免或減輕肺損傷的發(fā)生,將有助于提高膿毒癥患者的成功救治率。肺組織中最多的非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞是肺泡巨噬細(xì)胞[14],膿毒癥發(fā)生時(shí),肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs/NF-κB炎癥通路活化,導(dǎo)致大量炎癥基因的轉(zhuǎn)錄活化,失控性釋放大量炎癥因子,形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng),導(dǎo)致ALI的發(fā)生。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要致病成分,是導(dǎo)致TLRs/NF-κB活化的常見因子。本研究結(jié)果顯示,LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后,導(dǎo)致TNF-α分泌顯著增加。
白藜蘆醇是一種多酚類化合物,是天然的植物抗菌素。它能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞的活化,減少細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的釋放,避免或減輕膿毒癥時(shí)肺損傷,提高膿毒癥時(shí)肺損傷的治療效果[1-5,15]。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí),白藜蘆醇預(yù)處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞后,能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α 的產(chǎn)生,并且其抑制作用呈劑量依賴性。
miRNAs是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA,通過識(shí)別靶基因mRNA的3’ 端非編碼區(qū)來抑制靶蛋白的翻譯或促進(jìn)靶基因的降解[16-17]。miRNAs通過抑制炎癥相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),在炎癥反應(yīng)調(diào)控中具有重要作用。miR-146a在TLRs/NF-κB通路中具有重要調(diào)控作用。它的靶基因是TLRs/NF-κB通路中的兩個(gè)重要接頭蛋白編碼基因IRAK-1和TRAF-6。miR-146a上調(diào)后將負(fù)性調(diào)控TLRs/NF-κB通路,能夠抑制炎癥介質(zhì)的升高[6,18]。并且已證實(shí)miR-146a參與調(diào)節(jié)了LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[7-8]。在本實(shí)驗(yàn)中,用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后,也誘導(dǎo)了miR-146a的表達(dá)上調(diào),與前者報(bào)道結(jié)果相似。
研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇通過影響miRNA前體的轉(zhuǎn)錄和miRNA的加工成熟,能特異性地引起一些miRNAs改變,包括miR-21、miR-146a、miR-663等,這些miRNAs都參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇預(yù)處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞后,能明顯促進(jìn)miR-146a的表達(dá)上調(diào),并且相比于較低質(zhì)量濃度白藜蘆醇組(1 μg/mL組),較高質(zhì)量濃度白藜蘆醇組(10 μg/mL)更能誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá)。
綜上所述,在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中,白藜蘆醇能夠抑制炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生,并上調(diào)miR-146a的表達(dá),由此筆者可以推測(cè),白藜蘆醇調(diào)控炎癥的機(jī)制之一可能是通過升高細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)水平來發(fā)揮其抗炎作用。
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(收稿日期:2013-05-07)
DOI:10,3760/cma,j,issn,1671-0282,2014,01,009
基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(81060152);江西省自然科學(xué)基金(2009GZY0215)
作者單位:330006 南昌,南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(曾振國、邵強(qiáng)、丁成志、卿城、劉芬、詹以安、聶成、錢克儉),腫瘤科(李勇),影像科(龔洪翰);南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室(揭克敏)
更驚奇的發(fā)現(xiàn)是,我在翻閱這本字典時(shí),找到一張已經(jīng)變了顏色的“白雪公主泡泡糖”的包裝紙,那是一張長(zhǎng)條的鮮黃色紙,上面用細(xì)線印了一個(gè)白雪公主的面相,于今看起來,公主的圖樣已經(jīng)有一點(diǎn)粗糙簡(jiǎn)陋了。至于如何會(huì)將白雪公主泡泡糖的包裝紙夾在字典里,更是無從回憶。
到底是在上國語課時(shí)偷偷吃泡泡糖夾進(jìn)去的?是夜晚在家里溫書吃泡泡糖夾進(jìn)去的?還是有意保存了這張包裝紙呢?翻遍國語字典也找不到答案。記憶仿佛自時(shí)空遁去,渺無痕跡了。
唯一記得的倒是那一種舊時(shí)鄉(xiāng)間十分流行的泡泡糖,是粉紅色長(zhǎng)方形十分粗大的一塊,一塊五毛錢。對(duì)于長(zhǎng)在鄉(xiāng)間的小孩子,那時(shí)的五毛錢非常昂貴,是兩天的零用錢,常常要咬緊牙根才買來一塊,一嚼就是一整天,吃飯的時(shí)候把它吐在玻璃紙上包起,等吃過飯?jiān)俜诺娇诶锝馈?/p>
父親看到我們那么不舍得一塊泡泡糖,常生氣地說:“那泡泡糖是用腳踏車壞掉的輪胎做成的,還嚼得那么帶勁!”記得我還傻氣地問過父親:“是用腳踏車輪做的?怪不得那么貴!”惹得全家人笑得噴飯。
說是“白雪公主泡泡糖”,應(yīng)該是可以吹出很大氣泡的,卻不盡然。吃那泡泡糖多少靠運(yùn)氣,記得能吹出氣泡的大概五塊里才有一塊,許多是硬到吹彈不動(dòng),更多的是嚼起來不能結(jié)成固體,弄得一嘴糖沫,趕緊吐掉,坐著傷心半天。我手里的這一張可能是一塊能吹出大氣泡的包裝紙,否則怎么會(huì)小心翼翼地來做紀(jì)念呢?
我小時(shí)候并不是很乖巧的那種孩子,常常為著要不到兩毛錢的零用就賴在地上打滾,然后一邊打滾一邊偷看母親的臉色,直到母親被我搞煩了,拿到零用錢,我才歡天喜地地跑到街上去,或者就這樣跑去買了一個(gè)白雪公主,然后就嚼到天黑。
長(zhǎng)大以后,再也沒有在店里看過“白雪公主泡泡糖”,都是細(xì)致而包裝精美的一片一片的“口香糖”;每一片都能嚼成形,每一片都能吹出氣泡,反而沒有像幼年一樣能體會(huì)到買泡泡糖靠運(yùn)氣的心情。偶爾看到口香糖,還會(huì)想起童年,想起嚼白雪公主的滋味,但也總是一閃即逝,了無蹤跡。直到看到國語字典中的包裝紙,才坐下來頂認(rèn)真地想起白雪公主泡泡糖的種種。
如果現(xiàn)在還有那樣的工廠,恐怕不再是用腳踏車輪制造,可能是用飛機(jī)輪子了――我這樣游戲地想著。
那一本母親珍藏十幾年的國語字典,薄薄的一本,里面缺頁的缺頁、涂抹的涂抹,對(duì)我已經(jīng)毫無用處,只剩下紀(jì)念的價(jià)值。那一張泡泡糖的包裝紙,整整齊齊,毫無毀損,卻寶藏了一段十分快樂的記憶;使我想起真如白雪一樣無瑕的少年歲月,因?yàn)樗菢影?,那樣純凈,幾乎所有的事物都可以涵容?/p>
那些歲月雖在我們的流年中消逝,但借著非常微小的事物,往往一勾就是一大片,仿佛是草原里的小紅花,先是看到了那朵紅花,然后發(fā)現(xiàn)了一整片大草原,紅花可能凋落,而草原卻成為一個(gè)大的背景,我們就在那背景里成長(zhǎng)起來。
那朵紅花不只是白雪公主泡泡糖,可能是深夜里巷底按摩人的幽長(zhǎng)的笛聲,可能是收破銅爛鐵老人沙啞的叫聲,也可能是夏天里賣冰淇淋小販的喇叭聲……有一回我重讀小學(xué)時(shí)看過的《少年維持的煩惱》,書里就曾夾著用歪扭字體寫成的紙片,只有七個(gè)字:“多么可憐的維特!”其實(shí)當(dāng)時(shí)我哪里知道歌德,只是那七個(gè)字,讓我童年伏案的身影整個(gè)顯露出來,那身影可能和維特是一樣純情的。
鴻雁外語學(xué)校四年級(jí)李松石
誠實(shí)的味道真好!那么美妙,那么開心!你品嘗過嗎!
記得有一回,我去樓下的小賣店買東西,偶然發(fā)現(xiàn)那里有很多種可以做游戲的卡片,同學(xué)之間可以用來比賽輸贏的,于是我就花一元錢買了兩個(gè),順手放進(jìn)了褲兜里,然后又買了一些別的東西。當(dāng)我去算賬的時(shí)候,給了店主十元錢,他看了我買的東西之后,又找回一元錢。哦,他不知道我還買了兩張卡片。我就告訴他卡片的事,并掏出來給他看,然后把那一元錢又還給了他。店主贊許地向我點(diǎn)點(diǎn)頭,我感受到了誠實(shí)的美好,那是讓人快樂的味道啊!
都有其潛在市場(chǎng)
關(guān)鍵是 如何讓消費(fèi)者去接觸到它
并認(rèn)知它
由于廠子不景氣,還由于其它一些原因,我竟然下崗了。想我堂堂七尺男兒,滿腹經(jīng)綸,誰比誰差多少呢?可找了幾個(gè)工作,都不滿意。于是,便想到熱鬧的商海里一試身手。
可妻子根本不同意,理由是你沒有資本,又沒有經(jīng)商經(jīng)驗(yàn),你去做買賣,全家還不得喝西北風(fēng)?
得不到支持,不敢貿(mào)然行動(dòng)??尚睦锸冀K沒放下這個(gè)想法,平日里開始留心有關(guān)信息,琢磨著選擇怎樣的項(xiàng)目,開個(gè)好頭,試試自己的能力,也讓妻子信服。
機(jī)會(huì)終于來了。一種北京生產(chǎn)的拼音模板引起了我的興趣。這種模板專為兒童學(xué)習(xí)漢語拼音而設(shè)計(jì),經(jīng)過試用,產(chǎn)品效果顯著,并且已經(jīng)得到了國家教育委員會(huì)的推薦。不是說女人和孩子的錢最好賺嗎,就選它了。
向廠家詢問,得知本地經(jīng)銷商已經(jīng)批量進(jìn)貨。利用星期天到了經(jīng)銷公司,老板說零售每個(gè)十幾元,300個(gè)以上批發(fā)。仔細(xì)看了看產(chǎn)品實(shí)物、說明,并寫了幾個(gè)拼音字母試了試,感覺不錯(cuò)。
回去的路上,心里便開始盤算:300個(gè)起批發(fā),最低要1000多元,小試一下,未嘗不可;產(chǎn)品也不錯(cuò),關(guān)鍵是怎樣銷出去。找關(guān)系,通過教育系統(tǒng)層層往小學(xué)校攤派?國家明文規(guī)定嚴(yán)禁;到學(xué)校教室里推銷?影響不好,學(xué)校不讓;挨家挨戶推銷?又不知誰家有兒童剛上學(xué),滿天撒網(wǎng),一個(gè)人勢(shì)單力薄,收益不大。
這樣琢磨著,眼看快開學(xué)了。一天,聽同事說起在接孩子時(shí),看到學(xué)校門口附近宣傳推銷一種高效補(bǔ)鈣產(chǎn)品的,便買了一盒。真是說者無心,聽者有意,一下啟發(fā)了我。對(duì),就在學(xué)校門口設(shè)攤推銷。一來小學(xué)校是使用這種拼音模板的小小消費(fèi)者最集中的地方,上學(xué)、放學(xué),至少要接觸兩次,保證有足夠的產(chǎn)品刺激;二來現(xiàn)在都是獨(dú)生子女,家家都望子成龍,盼女成鳳,為了學(xué)習(xí)不落伍,花10多塊錢,簡(jiǎn)直小意思;況且去接送孩子的都是父親、母親、爺爺、奶奶、外公、外婆,手中有錢,可以當(dāng)場(chǎng)購買。
主意一定,便三番五次地游說,妻子終于批準(zhǔn)了2000元資金,準(zhǔn)許小試一回。
300個(gè)拼音模板搬回了家,要了些廣告資料,到舊貨市場(chǎng)上買了一張小課桌,新涂了漆,又制作了一條橫幅,上書:
之后,對(duì)本市的小學(xué)校作了一番調(diào)查,初選了10多個(gè)聲譽(yù)較好、交通便利的小學(xué)校,將其中一家有4個(gè)一年級(jí)班、150多名新生的鐵路小學(xué)校作為了重點(diǎn)。
暑假過去了,開學(xué)的日子到了。我提前請(qǐng)了假,早上7點(diǎn)鐘,便來到鐵路小學(xué)校門口,放下小課桌,擺好拼音模板,掛起橫幅,耐心地等待小客戶光臨。
過了7點(diǎn)鐘,小學(xué)生們?cè)跔敔敗⒛棠?、爸爸、媽媽的護(hù)送下,陸陸續(xù)續(xù)地入校了。使我感到不解的是,直到8點(diǎn)鐘上課,竟然很少有人光顧我的拼音模板,更不用說買下。產(chǎn)品質(zhì)量差?價(jià)格高?不實(shí)用?可這是連國家教委都發(fā)文推薦的教學(xué)用具啊,就算是質(zhì)量差,價(jià)格高,不實(shí)用,你也應(yīng)該湊湊熱鬧,問一問,看一看嘛!
等到了晚上,我才猛然意識(shí)到,雖然選擇了一個(gè)正確的地點(diǎn)。但選擇的時(shí)機(jī)是錯(cuò)誤的,小學(xué)生們的精力是有限的,都被新入學(xué)、新學(xué)期開學(xué)等新事物所吸引,家長(zhǎng)們也都為孩子新學(xué)期第一天上學(xué)所牽制,又有誰會(huì)給我的拼音模板一些關(guān)注呢!這樣一想,便安慰自己,雖然今天出師未捷,但相信隨著開學(xué)日久,我的拼音模板會(huì)引起注意的。
果然,以后的幾天里,隨著一年級(jí)新生拼音課的開始,關(guān)注拼音模板的家長(zhǎng)和學(xué)生逐漸增多起來,在我的介紹和演示下,部分家長(zhǎng)抱著試一試的態(tài)度買了下來。遺憾的是,一個(gè)星期過去了,300個(gè)拼音模板,只賣出了8個(gè)。這樣下去,如何了得?
雙休日,閉門思過。拼音模板是一年級(jí)小學(xué)生學(xué)習(xí)拼音用的,他們才是最終消費(fèi)者,必須引起他們的注意。怎樣才能引起他們的注意呢?聯(lián)想到當(dāng)今流行的商家贈(zèng)送禮品的做法,我決定,向每一個(gè)詢問拼音模板的小學(xué)生贈(zèng)送一樣小禮品。送什么呢?不能太貴,太貴送不起;又不能太差,太差不吸引人。最后決定,每人送一塊電視廣告常見的“大大”泡泡糠,2角錢,還可以承受,足以引起小學(xué)生的注意了。
考慮到兒童消費(fèi)還有一個(gè)特點(diǎn),就是家長(zhǎng)要把關(guān)。如何讓家長(zhǎng)認(rèn)識(shí)到拼音模板的優(yōu)越性,也就是認(rèn)識(shí)到拼音模板的確可以讓孩子學(xué)習(xí)拼音更快、更好呢?成人購物,主要是擔(dān)心產(chǎn)品沒有宣傳的效果那樣好,怕花了冤枉錢。既然這樣,何不免費(fèi)試用一天呢?
免費(fèi)試用倒是可以,可是如何擔(dān)保呢?預(yù)收押金?流動(dòng)攤點(diǎn),無論你收多少押金,家長(zhǎng)們總是對(duì)你不信任,懷疑這里有圈套;可總不能什么物證都沒有、完全靠小學(xué)生和家長(zhǎng)們的自覺?!叭酥?,性本善”、想到絕大多數(shù)人是誠實(shí)的,又想到小學(xué)生最聽老師的話,都努力作個(gè)誠實(shí)的好孩子,便有了主意。綜合起來,“游戲”規(guī)則是:
每一個(gè)對(duì)拼音模板感興趣的小朋友,均可免費(fèi)試用一天,并獲贈(zèng)一塊“大大”泡糖,唯一的條件是,由小朋友在記錄本上親手簽名。想你小小兒郎,斷不會(huì)因要貪我一個(gè)拼音模板而把自己的名字張三寫作李四。
于是又忙著為新游戲準(zhǔn)備道具。批發(fā)了兩大盒“大大”牌泡泡糖,又買了幾個(gè)五顏六色的氣球,新做了一塊一平方米的宣傳告示牌。上書: 并畫了幾個(gè)兒童吹泡泡糖的彩色畫。
兩天的休息日很快過去了。星期一,我又早早地來到小學(xué)校門口,放下小桌子,掛好氣球,擺好樣品,拿出泡泡糖,將宣傳牌放在醒目的位置上,開始等待我的小顧客光臨。
過了7點(diǎn)鐘,上學(xué)的小學(xué)生逐漸多起來了,都被彩色大氣球和宣傳畫吸引住了,紛紛圍攏上來;而家長(zhǎng)們?cè)诮?jīng)過對(duì)孩子一個(gè)星期的輔導(dǎo)體驗(yàn)之后,則對(duì)這種學(xué)習(xí)拼音的模板給予了更多的關(guān)注。我則不失時(shí)機(jī)一遍又一遍地向他們說明“游戲”規(guī)則:
“一、二年級(jí)的小朋友和家長(zhǎng)們,大家今天可以將這種拼音模板拿回家,按照說明書的介紹,教自己的孩子練習(xí)寫拼音,看一看真正的效果如何;對(duì)領(lǐng)取拼音模板的小朋友,免費(fèi)贈(zèng)送一塊大大泡泡糖。明天早晨這個(gè)時(shí)間,如果您決定買,再交錢給我;如果您不買,請(qǐng)把拼音模板還給我,分文不收;我們這樣做,唯一的條件是:由您的孩子在這本記錄本上親筆簽名,作為證明就可以了。”
經(jīng)過兩、三輪如此這般的解說,本來小朋友們對(duì)泡泡糖就感興趣,家長(zhǎng)對(duì)拼音模板感興趣,現(xiàn)在居然免費(fèi)品嘗、免費(fèi)試用,這等好事,何樂而不取!便紛紛擠上來,簽名登記,領(lǐng)取拼音模板和泡泡糖,我則一再強(qiáng)調(diào):大家都是誠實(shí)的人,明天早晨,一定前來,或是交錢買下,或是退還拼音模板。
這樣忙了有半個(gè)多小時(shí),等小學(xué)生們都進(jìn)了教室,周圍清凈的時(shí)候,我數(shù)了數(shù),帶去的100個(gè)拼音模板,還剩下42個(gè),也就是說,今天一早發(fā)出58個(gè)模板。我不禁心花怒放起來,如果明天這些模板全部被買下,我就可以凈賺3O0多元。難道做生意,就這么簡(jiǎn)單?
晚上,向妻子匯報(bào)工作,妻子說:冷靜點(diǎn),小心人家賴賬,讓你賠上300多元。我看,有一半人買就不錯(cuò)了。
星期二,我又帶了lO0個(gè)模板,比往常更早地來到學(xué)校門口,擺好陣勢(shì),恭候家長(zhǎng)和小學(xué)生們的到來。沒想到的是,今天比昨天更忙碌,有經(jīng)試用后決定買了拼音模板,前來交錢并要求劃掉簽名記錄的;有聽了小伙伴或是家長(zhǎng)們的鼓動(dòng),前來索取拼音模板試用并要泡泡糖的;也有認(rèn)為效果不理想,歸還拼音模板的。搞得我手忙腳亂,滿頭大汗。
再一次清靜下來的時(shí)候,我仔細(xì)地進(jìn)行盤點(diǎn)、第一天的有7個(gè)交還,實(shí)際成交51個(gè),手中尚余63個(gè)拼音模板,扣除了第一天的7個(gè),今天一共發(fā)出44個(gè)。如此一算。心中實(shí)實(shí)在在高興起來,第一天已經(jīng)凈賺了300多元,按第一天的成交率計(jì)算,再賺2O0元沒問題。
再回家向妻子匯報(bào)工作的時(shí)候,妻子也喜不自禁,幫著算賬,并提醒說,要不要再進(jìn)些貨?泡泡糖還夠不夠?
考慮到“早發(fā)早收”占用時(shí)間太長(zhǎng),當(dāng)天下午4點(diǎn)鐘,攜帶東西又去了鐵路小學(xué),并將“早發(fā)早收”的游戲改為“晚發(fā)早收”,即晚上發(fā)放,次日早回收(錢或模板)的辦法。星期三上午,看看已售出120多個(gè),差不多了,便不再發(fā)放,結(jié)清了賬目,結(jié)束了在鐵路小學(xué)的游戲,轉(zhuǎn)移到另外一所小學(xué)校,重開戰(zhàn)場(chǎng)。
相信大家都喜歡粗(吃)泡泡糖吧。但我不喜歡吃。。。。。。因?yàn)?,泡泡是我班男生拉,難道要吃了他嗎?
他很瘦小、也很黑,好象一陣風(fēng)就可以把他吹倒,也像一個(gè)不強(qiáng)壯的非洲人。唯一讓我崇拜的是他叫泡泡(可愛滴名字),聽說,我的朋友暗戀他。是的,真的很奇怪他那么丑,真是值得議論的話題拉~~
而糖——是一個(gè)很酷的男生,每天只穿著一件令人討厭的黑衣服,頭發(fā)碎碎爛爛,看起來就像黑社會(huì)的老大。。。。。。但他很“斯文”,其實(shí)是一個(gè)經(jīng)常搗蛋的家伙。
說起上次春游(奸笑ING。。。)一下車,我和淡紫(淡紫女生)就覺得好象有人在跟蹤,誰知糖總在我們面前“湊巧”出現(xiàn)了幾次,以JP一族的我們當(dāng)然神機(jī)妙算拉原來是他(糖)在我們玩別的游戲之前,就隱約看到他(糖)的身影,是那么孤單,是那么朦朧,是那么偷偷摸摸。。。。。。后來,我玩翻滾飛船的時(shí)候,就看到他(糖)在那排隊(duì)。旁邊還有2班的男生——舉,他也很酷的,但在我眼里不是那么酷。我下來了,他們上去時(shí),眼神很恐怖。轉(zhuǎn)時(shí),糖快不行了,但勉強(qiáng)挺過去。舉很強(qiáng),這么緊張的時(shí)刻,他還是沖著浪風(fēng)在酷中翱翔,很引人注目。恩,我抬頭望著,糖也不時(shí)望了望然后繼續(xù)頂著風(fēng)給他的刺激。當(dāng)時(shí),我說了一句超感人的話,可能他忍不住流淚了,下來時(shí),只見他沖向上車的方向,頭也不回。而2班的舉,只是在羨慕中碰到了另一位女生——蟲蟲(她好洋衰的),是我以前的好朋友,蟲蟲不停地纏著他不放說要送他一份禮物(我們看到都偷笑)狠心的舉拒絕了,直奔上車站。當(dāng)然拉,蟲蟲不肯放過良機(jī)(真是出了名的死纏爛打)直跟著他走就向跟屁蟲(當(dāng)之不愧的蟲蟲)。。。。。。
[未完待續(xù)]
“鉛筆盒,5塊錢1個(gè),贈(zèng)小鉛筆袋1個(gè),買一贈(zèng)一!實(shí)惠,快來買喲!”在這么熱鬧的地方,你問我在干什么?告訴你,我們學(xué)校搞了個(gè)義賣會(huì),我正參加義賣呢。同學(xué)們從家里拿來了許多看過的書、沒用過的筆記本、玩具、模型和一些學(xué)習(xí)用具,真是琳瑯滿目。我們組的成員帶來的東西更為特別,許多同學(xué)圍著我們的攤位挑來挑去,看來看去,可忙倒了我們這幾位攤主。當(dāng)中,有兩個(gè)男同學(xué)同時(shí)看中了一本叫《電腦游戲大全》的書,發(fā)生了爭(zhēng)執(zhí)。有人在旁邊說,你們倆開個(gè)價(jià),誰價(jià)高誰把書拿走!“3塊”,一個(gè)男孩立刻說了個(gè)價(jià),“6塊”,另一個(gè)男孩道,“7塊!”“停!”我朝他們喊了一聲,“對(duì)不起,我們這兒售出的最高價(jià)是6塊,所以這本書歸他了!”報(bào)價(jià)6塊的男生聽了趕緊掏出了“大票”遞過來,興高采烈地把書拿走了。
我們組的另一個(gè)攤位前已經(jīng)排起了一條“長(zhǎng)龍”。這兒是個(gè)抽獎(jiǎng)活動(dòng),抽獎(jiǎng)規(guī)則非常有趣,凡到此參加抽獎(jiǎng)活動(dòng)的人都要交1塊錢的參與費(fèi),每人限抽兩次,若抽中偶數(shù)元的東西會(huì)降一半的錢賣出,而抽中奇數(shù)元的東西會(huì)漲一倍賣出。“哎,我抽了個(gè)8塊錢的貯錢罐!”“4塊,給你!”“我抽了個(gè)3塊錢的卡通簽字筆!”“6塊,給你!”“哎呀,我運(yùn)氣怎么這么不好?只抽到兩塊不要錢的泡泡糖。”其實(shí)大多數(shù)人都是抽到了泡泡糖。不管是抽到獎(jiǎng)的還是沒有抽到獎(jiǎng)的,大家臉上都掛著興奮和快樂。
“釘呤呤”,“翠微小學(xué)義賣活動(dòng)到此結(jié)束。”隨著張校長(zhǎng)的話語,我們開始收拾自己的東西。老師讓我統(tǒng)計(jì)一下本班的收入情況,236塊,收入還不少呢。
第二天,我和其他班的幾位同學(xué),代表各自的班級(jí),隨著大隊(duì)部老師,把義賣的錢全部捐給了愛心基金會(huì),那里的叔叔阿姨還跟我們合了影呢!
學(xué)校:福建晉江永和重華中心小學(xué)王錚
聯(lián)系電話:88083004
指導(dǎo)老師:王建國
食指運(yùn)動(dòng)會(huì),大家聽了可能摸不著頭腦——食指運(yùn)動(dòng)會(huì)是什么呢?今天,我就與同學(xué)玩了這個(gè)游戲,所謂的食指運(yùn)動(dòng)會(huì)就是“推河比賽”。
游戲規(guī)則很簡(jiǎn)單:老師先把我們分成4個(gè)小組,三人一小組,再折斷牙簽的一半當(dāng)中線,每個(gè)人只能用食指來較量,要在十秒鐘之內(nèi)將尺子推向?qū)Ψ?,?組中選出冠軍。到底“小組比賽的冠軍”花落誰家,我們拭目以待。
我有一個(gè)糖果屋,我的糖果屋有五顏六色的糖果,有許許多多的功能,還有有趣又精彩的游戲,屋子的形狀也很好看。
有紅色、黃色、粉紅色、綠色、藍(lán)色、棕色、橙色、白色、灰色、黑色、紫色、金色和銀色的糖果。紅色是和草莓味的。黃色是橘子味。粉紅色是水蜜桃的。綠色是石榴味的。藍(lán)色是泡泡糖。棕色是奇異果的味道。橙色是橙子味的。白色的是棉花糖。灰色和黑色是可樂糖。紫色是火龍果味的糖。金色的是玉米味的,銀色的是棒棒糖。
功能一:有一臺(tái)畫畫機(jī)。它是正方形的,它身上有一張白紙。只要你拿起它手上的筆,在白紙上畫畫,畫好了,把筆拿給它,就會(huì)對(duì)你畫好的畫進(jìn)行改分。如果你得到了九十分以上,就可以得到每一種顏色的糖各一個(gè)。
功能二:有一個(gè)高高的身高器。它高三米,寬一米。只要你站到指定的位置,它就會(huì)在一秒之內(nèi),知道你的身高,它還會(huì)說出你有多高。如果你有130厘米,它就給你30糖。想要多秒少味,就拿什么味。
功能三:有一個(gè)三人探答機(jī),只要三個(gè)人到了,就可以玩搶答游戲了。誰答對(duì)的題最多,就可以得到三個(gè)棒棒糖。
功能四:我的助手還發(fā)明了一個(gè)小東西,它叫賣糖機(jī),你給他一元錢,他就會(huì)給你十顆糖。你給他兩元錢,它就會(huì)給你二十顆糖
我的糖果屋有兩個(gè)游戲,第一個(gè)是謎語游戲,他會(huì)問你一個(gè)謎語。如果你答對(duì)了,就會(huì)得到2元錢。第二個(gè)游戲是足球游戲,踢中一個(gè)門得到兩顆棉花糖。我還記得有一次,有人在踢球,他邊踢邊說:“看我飛毛腿!”后來,他果然踢中了,他甜甜地笑了,高高興興帶著2顆棉花糖回家了。
我的糖果屋是小貓的形狀。小貓屋是七種顏色的,有紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫色。小貓嘴里有一條魚。這個(gè)糖果屋有三層樓。我給這個(gè)貓屋取了一個(gè)名字。就叫“妙妙屋”!
歡迎大家能來我的糖果屋。
2、孩子是一顆勃發(fā)的種子,正在奮力長(zhǎng)大;孩子是一朵嬌艷的花蕾,正在含苞待放。兒童節(jié),在這個(gè)孩子的節(jié)日中,為你送上一份孩子般的祝福,祝你節(jié)日快樂。
3、一兒童節(jié),祝你臉上掛滿童真的笑臉,生活如童年般無憂,事事如童年般簡(jiǎn)單,遇上數(shù)不盡的童心。愿你天天過六一,天天好心情。
4、你是否還記得兒時(shí)的歌謠;是否還記得母親的懷抱;是否還記得清脆的口哨;是否還記得游戲的墻角。今天是兒童節(jié),愿你重拾童年記憶,青春永葆!
5、送你開心棒棒糖,甜甜你;送你歡樂泡泡糖,逗逗你;送你一塊小手絹,擦鼻涕;聽說你總是很淘氣,以后要改改這個(gè)壞脾氣,兒童節(jié)到了,祝你開心!
6、日子把風(fēng)霜刻在了臉上,歲月把回憶印在心頭;但童心是一種心態(tài),即使歲月蹉跎,時(shí)光消逝,珍惜它,愛惜它,你將年輕永駐,六一兒童節(jié),記得保持童心!
7、一快到了,我忙栽下童話的樹苗,澆上童趣的清水,綻開天真的花朵,結(jié)出快樂的果實(shí),用幸福的短信傳遞給你,提前祝你六一兒童節(jié)開心!
8、孩子我有塊神奇的橡皮泥,我把它捏成幸福陪你一生,捏成快樂陪你一生,捏成健康陪你一生,今天是六一兒童節(jié),我要用它捏出時(shí)間陪你度過快樂的兒童節(jié)!
9、童心爛漫,將快樂連線;童心純潔,讓好運(yùn)不絕;童心蕩漾,使身體健康;童心可愛,把日子描彩。六一兒童節(jié),愿你永葆無瑕童心,欣賞一路風(fēng)景!