拉曼光譜在檢驗醫(yī)學中的應用分析
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拉曼光譜（Ramanspectra）屬于散射光譜范疇，是光與物質相互作用而產生的［1］。在20世紀20年代由印度科學家C．V．拉曼首次發(fā)現并命名。單色光入射到某一介質后產生的散射光大部分只發(fā)生方向的改變，其頻率與入射光保持一致，稱為瑞利散射；另有極少數散射光，其傳播方向及光波頻率均發(fā)生改變，這樣的散射就稱為拉曼散射［2］。拉曼首次提出分子可以改變入射光頻率的理論，且改變量與散射層面分子的化學結構相關聯。后續(xù)研究發(fā)現散射層面的分子結構、分子基團以及電子化環(huán)境均會對散射光頻率產生影響，而這些影響是根據材料特定的，從而可以通過散射光特點對物質進行定性和定量分析［3］。由于拉曼光譜技術及由拉曼光譜術衍生出的亞技術在物質檢測方面具有高效、簡便、無破壞性、成本低、非接觸性、樣本量少、樣本無需特殊制備、可重復性高、穩(wěn)定且不會對被試樣本造成物理和化學分解破壞等特點已被廣泛應用于化工、刑偵、生物制藥、醫(yī)學檢驗等領域，并取得了多項進展，是目前無損分析檢測領域的關注焦點［4－6］。近年來利用拉曼光譜技術開展的各項病變組織的檢測和疾病診斷分析引起了醫(yī)學界的廣泛關注，也為現代醫(yī)學檢驗學敞開了新的大門，促進了疾病診斷技術的發(fā)展［7］。本文就拉曼光譜在檢驗醫(yī)學中的應用展開綜述。
1拉曼光譜在醫(yī)學檢驗中的應用
1．1在病原微生物檢測中的應用
微生物細胞膜表面有大量已知的生化成分可以看作是微生物的特征性標志，因而可以作為菌種快速識別和鑒定的判斷標準。利用拉曼光譜可以在不依賴培養(yǎng)基的情況下直接對患者體內分離下來的或實驗室中保存的單一菌種或混合菌群進行快速鑒別及分析［8］。美國華盛頓州的研究人員利用拉曼光譜對從臨床患者和醫(yī)院環(huán)境中分離得到的7株副溶血弧菌進行了分析，結果發(fā)現7株菌株都有其各自不同于其他菌株的特征峰。他們還將其中2株副溶血弧菌菌株分別按照1∶2、1∶1和2∶1的比例混勻后分別利用拉曼光譜檢測，結果顯示可以通過2株細菌各自的特征峰將兩者明確區(qū)別開來，其中一株副溶血弧菌的特征峰出現在了1002cm－1、1177cm－1和1532cm－1處，而另一株副溶血弧菌的特征峰卻分別出現在了525cm－1、738cm－1、1319cm－1和1639cm－1處，證明拉曼光譜無論在單一菌種標本還是混合菌群標本中均具有良好的分析鑒定能力［9］。另有研究發(fā)現結合使用拉曼光譜和化學計量法可以鑒別微生物的種類及各自血清型，已有實驗利用銀納米顆粒作為基底對綠豆芽中的李斯特菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌等6種食物源性致病菌進行了拉曼光譜的鑒定和區(qū)分［10］。有研究報道對日常生活中主要的食物源性致病菌進行了拉曼光譜分析，從而對細菌進行等級劃分，第一級便是區(qū)分革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，另外通過各自特征峰區(qū)別不同細菌菌屬，結果顯示各級的識別結果準確度均在91％以上［11］。利用拉曼光譜技術與微流控芯片相結合的辦法，毛麗華等人設計并建立了拉曼光譜－微流控芯片自動化檢測系統(tǒng)，檢測并統(tǒng)計了珠蛋白生成性障礙貧血型紅細胞與健康人紅細胞的拉曼光譜值，通過在1004cm－1、1130cm－1、1450cm－1等拉曼光譜特征峰的數據對比，發(fā)現了珠蛋白生成障礙性貧血型紅細胞的血紅蛋白寬度較健康人紅細胞廣，并以此發(fā)現了新的快速、便捷的檢測珠蛋白生成障礙性貧血的檢驗醫(yī)學技術。另有研究者也利用拉曼光譜技術與微流控芯片相結合的辦法從十多種細菌混合的菌群中對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進行了快速分析研究。結果表明耐甲氧西林金黃色葡萄球菌較其他細菌有其獨特的拉曼波峰，并且整個檢測過程用時只需20s時間，在檢驗精度上也與傳統(tǒng)PCR技術、免疫學檢測技術所得到的結果相似［12］。該方法簡便快速，安全可靠，非常適合用于衛(wèi)生稽查部門的快速檢驗。
1．2在腫瘤檢驗中的應用
目前在全世界范圍內依然沒有很好的針對腫瘤的治療手段，腫瘤的分期對預后起著決定性的影響，那么對腫瘤的早發(fā)現、早診斷、早治療就擺在了尤為突出的地位［13］。在腫瘤組織中，在細胞發(fā)生病理學手段可觀測到的形態(tài)惡變之前，其實已經存在由細胞增殖分裂分化或一些信號蛋白的產生等引起的細胞中遺傳物質、蛋白質和脂類的結構和含量改變，而這些細微的改變可以及時通過拉曼光譜檢測反映出來［14］。因而在腫瘤檢驗中拉曼光譜技術具有傳統(tǒng)病理學檢測所無法替代的功能用途，對腫瘤的早期診斷有巨大幫助。實驗證明拉曼光譜可用于癌變組織與正常組織的鑒別。早在1991年就有人率先對拉曼光譜的腫瘤檢驗學價值進行了報道。他們發(fā)現正常乳腺組織與腫瘤組織甚至良性腫瘤與惡性腫瘤的拉曼光譜在700～1900cm－1存在著明顯差別，且對應的各自拉曼峰相對強度也存在顯著差異［15］。從此掀開了拉曼光譜應用于早期腫瘤診斷的新時代。Gawinkowski等［16］對拉曼光譜技術進行改進設計了快速近紅外拉曼光譜檢測系統(tǒng)，進一步提高了檢測效率，可在5s內快速測得活體皮膚的拉曼光譜。隨即該科研團隊利用此系統(tǒng)對肺癌組織進行拉曼光譜檢測，結果顯示肺癌組織的拉曼光譜特征與正常肺組織之間存在明顯差別。此后，該科研小組又成功獲得了亞洲人種皮膚黑色素組織的拉曼光譜數據。在對胃癌的在體拉曼檢測中研究人員將拉曼光譜技術與微型攝像機、圖像分光儀、雙極管激光發(fā)生器等結合建立了新型拉曼內鏡系統(tǒng)，也推動了內鏡技術的發(fā)展［17］。有學者利用激光作為拉曼光譜的激發(fā)光源，對15例手術切除且經病理確診為基底細胞癌的組織標本進行拉曼照射，同時與正常皮膚組織進行對比分析，結果顯示通過拉曼光譜檢測可以實現對基底細胞癌的高靈敏度診斷［18］。在對鼻咽癌組織和正常鼻咽組織的拉曼光譜比較中也有相似發(fā)現，它們在1290～1320cm－1，1420～1470cm－1和1530～1580cm－1這3處波段區(qū)間均存在明顯特征差異，可以作為鑒別要點。另有研究人員選用830nm波長激光對甲狀旁腺腺瘤組織標本及增生組織標本中的結節(jié)區(qū)域進行拉曼照射，重復了四十多次試驗，比較發(fā)現二者的拉曼光譜比較相似，但在蛋白質、脂質等某些特定波段仍存在可區(qū)別的差異，建立線性分析的數學模型可以很好地將二者區(qū)別開來［19］。對人體多處腫瘤組織的拉曼檢測均得到了較好的鑒別指標，預示著拉曼光譜在腫瘤學檢驗中將有寬廣的發(fā)展空間。
1．3在藥物分析檢測中的應用
拉曼光譜較早即應用于藥物檢驗領域。早期便有科研人員用共聚焦拉曼光譜儀對鹽酸曲馬多進行了檢測，所獲得的拉曼譜帶顯示圖譜峰形良好，峰強明顯，可以較準確地反映出鹽酸曲馬多的化學結構信息［20］。研究人員分析了倍他米松磷酸鈉和地塞米松磷酸鈉這兩種差向異構體的化學結構差異，分別對其固態(tài)及水溶飽和態(tài)進行了常規(guī)拉曼光譜檢測，并進一步對以銀膠為基底的這兩種藥物進行了增強拉曼光譜檢測分析，成功建立了這兩種差向異構體的拉曼區(qū)分系統(tǒng)，可以實現其快速區(qū)分鑒別的目的［21］?？蒲腥藛T采用傅里葉變換拉曼光譜法對不同產地且不同采集時間的野生及人工種植黃芩進行了分析研究，結果顯示利用該方法對中藥材的質量鑒定較傳統(tǒng)鑒別方法更快速簡便且不會對受檢樣品造成破壞，值得推廣。有學者在前人基礎上開創(chuàng)性地將拉曼光譜技術與光纖傳感技術相結合，實現了甲硝唑片的快速無損鑒別，尤其適合于藥品監(jiān)管部門對藥品快速檢驗。
1．4在眼部疾病檢驗中的應用
晶狀體是一具有高濃度蛋白質的雙凸面透明組織，其內蛋白變化對晶狀體功能改變具有決定性作用，對人眼屈光調節(jié)也有重要意義。利用拉曼光譜對晶狀體蛋白質的亞結構例如：氨基酸亞基、二硫鍵、羧基、巰基等的分析可以幫助人們更好地認識晶狀體及其調節(jié)模式。拉曼光譜技術引入眼部疾病的研究首先是測定了牛晶狀體中α、β和γ蛋白的拉曼圖譜，結果顯示α蛋白主要集中于核部而β蛋白主要集中于皮質部［22］。Short等［23］測試了紫外線誘導下的兔白內障晶狀體拉曼光譜，結果顯示氨基酸殘基中的羥基譜線強度顯著增加，無法與水形成氫鍵，從而科學地解釋了白內障晶狀體中水分的缺失。與此同時，研究中發(fā)現了多肽水解物的組成成分鄰氨基苯甲酸，暗示著光化學反應可以造成色氨酸殘基的下降。綜合現有發(fā)現，他們提出了紫外線誘導白內障發(fā)生的熱損傷學說。研究人員測試了誘發(fā)哺乳動物白內障的致病性光譜，以6月齡家兔為陰性對照組，以7月齡糖尿病家兔為糖尿病組，對比發(fā)現在900～1700cm－1，并無明顯差異，而在800～850cm－1兩組差異明顯［24］。分析后認為誘發(fā)晶狀體混濁的主要原因是α、β和γ晶體蛋白的不良聚合反應。
1．5在骨科疾病檢測中的應用
絕大部分生物樣本都有自體熒光，而熒光的強背景會對拉曼光譜造成很大的干擾，從而影響拉曼光譜的準確性。雖然關于引起骨組織光譜背景的物質尚不明確，但很有可能是一些有機基質中的某些非膠原蛋白分子［25］。如果在未處理的情況下，利用拉曼光譜對骨組織的檢測很不準確。隨后熊義等［26］發(fā)現了通過雙氧水法降低骨組織光譜背景的方法，從而為拉曼光譜在骨組織中的研究打開了大門。骨組織在發(fā)育成熟后其密度與硬度即隨生物力學環(huán)境的改變而改變，稱為骨重建。在人體整個生命進程中，骨質會伴隨著有所改變，利用拉曼光譜可以對這一過程進行深入研究。一旦吸收與沉積的動態(tài)平衡被打破，則會造成不同類型的骨科疾病。Oshokoya等［27］建立了以拉曼光譜為研究手段的外力作用下的顱縫早閉模型，研究內容涉及顱骨成分、骨質及基質的相對含量和分布。顱縫早閉癥是一種由多病因造成的顱縫發(fā)育異常綜合征，在嬰幼兒屬于常見疾病，由于顱縫過早閉合，限制了顱腔的容積，不利于智力的發(fā)展。結果顯示在非軸向壓力的作用下成骨區(qū)的前端礦物含量相比無壓力的狀態(tài)下有所下降，其原因可能是礦物沉積不完全［28］。在成骨不全癥的研究中，有學者利用拉曼光譜證實了成骨不全癥小鼠在6月齡后的骨強度增長不是由于骨形態(tài)改變引起的，而是由于骨基質的改進而達成的［29］。
2展望
縱觀歷史，人們已針對各種動物各種組織器官開展了大量的拉曼光譜研究并獲得很多突破性的進展，發(fā)明了許多新的檢驗技術。拉曼光譜在醫(yī)學檢驗中的作用越來越凸顯，并且越來越多的科技報道證明拉曼光譜技術應用于醫(yī)學檢驗有其獨特的優(yōu)勢與特點，諸如快速、準確、廉價、可靠等。即使前途一片大好，拉曼光譜技術在生物醫(yī)學檢驗學中的應用仍存在很多問題亟待解決，例如尚未建立不同物質的拉曼光譜特征峰信號庫、如何建立針對具體疾病的拉曼檢驗標準、如何建立活體組織的拉曼檢驗系統(tǒng)、如何排除復雜組織和成分的干擾、怎樣更好地與現行主流檢驗體系相融合等。目前仍留有很多關鍵性的問題亟待解決，拉曼光譜技術在檢驗醫(yī)學中的大面積普及依然任重道遠。
作者:郭美 魏昆 毛莉 劉曉紅 黃君富 府偉靈 審校 單位:第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院檢驗科