核酸檢測情況精選(九篇)

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第1篇：核酸檢測情況范文

關(guān)鍵詞：窗口期 艾滋病毒 核酸檢測

Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.03.619

【中圖分類號】R3 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2014）03-0399-01

獻血者血液必須經(jīng)過經(jīng)血傳播疾病病毒檢測合格，才能發(fā)往臨床，保證用血者的安全。傳統(tǒng)血液篩查采用酶聯(lián)免疫法對獻血者血液進行檢測，雖然酶聯(lián)免疫技術(shù)應(yīng)用已經(jīng)很成熟，但仍存在方法本身的限制，病毒感染“窗口期”較長。我站從2010年12月開始對常規(guī)酶免檢測合格的獻血者血液，增加艾滋病毒核酸（HIV DNA）檢測，檢出1例艾滋感染“窗口期”的獻血者，阻止了該獻血者血液進入臨床，感染患者，保證了輸血安全。現(xiàn)對該血液的檢測情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源。本站無償獻血者，男，20歲，追蹤采集獻血者標本3次。

1.2 試劑與方法。①ELISA檢測。對獻血者血液標本采用3種酶免試劑（北京萬泰試劑、法國伯樂試劑，均為4代試劑，可檢測P24抗原；珠海麗珠抗體檢測試劑）平行檢測抗-HIV1/2，操作中嚴格按照試劑說明書和本站操作規(guī)程進行操作。②核酸檢測。首次獻血標本經(jīng)酶免檢測合格，采用上海浩源核酸血液篩查試劑進行核酸檢測，核酸篩查陽性標本采用羅氏核酸定量試劑進行定量檢測。③蛋白印記確證檢測。對核酸陽性標本再進行蛋白印記確證實驗。

2 結(jié)果

2.1 追蹤采集標本時間及酶免和核酸檢測結(jié)果見表1。

3 討論

本例HIV RNA陽性標本，經(jīng)過對該獻血者的追蹤檢測，證明該獻血者獻血時正處于“窗口期”感染。血清學酶免檢測在第1次追蹤檢測時，進口伯樂試劑開始轉(zhuǎn)陽，而國產(chǎn)萬泰試劑和麗珠試劑仍為陰性，說明在獻血后第4天，血液中P24抗原已經(jīng)轉(zhuǎn)為陽性，且進口試劑靈敏度高于國產(chǎn)試劑。第2次和第3次追蹤檢測時，所有的血清學指標和蛋白印記確證試驗都轉(zhuǎn)為陽性，明確該獻血者被感染艾滋病毒，獻血時正處于感染窗口期。有文獻報道，核酸檢測技術(shù)可將HIV感染的“窗口期”縮短11天（縮短“窗口期”的50%）[1]。在本研究中，核酸檢測將病毒檢測的“窗口期”提前了4天。核酸檢測技術(shù)在我國還處于起步階段，在血液篩查中的必然性和重要性逐步顯現(xiàn)。隨著該技術(shù)在全國各采供血機構(gòu)中陸續(xù)開展，不斷提高血液檢測質(zhì)量，縮短病毒檢測“窗口期”，為社會提供安全、有效的血液，挽救患者生命。

第2篇：核酸檢測情況范文

關(guān)鍵詞：乙肝病毒；前S1抗原；脫氧核糖核酸；乙肝病毒e抗原

根據(jù)調(diào)查研究我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，前S1抗原是乙型肝炎病毒的重要組成部分，在肝細胞受乙型肝炎病毒感染中起著重要的作用。隨著我國近幾年對乙型肝炎、前S1抗原的研究發(fā)現(xiàn)前S1抗原在乙型肝炎診療中具有一定的應(yīng)用價值，本文對前S1抗原、脫氧核糖核酸、乙肝病毒e抗原的檢測進行研究，分析前S1抗原檢測技術(shù)的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取100例乙型肝炎患者，其中男性65例，女性35例，年齡在12～75歲，平均年齡為41.5歲，所有研究對象的表面抗原檢測均呈現(xiàn)陽性，符合肝炎病毒診斷標準，并排除了其他類型的肝炎。

1.2方法 前S1抗原、乙肝病毒e抗原的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，脫氧核糖核酸檢測采用實時熒光定量PCR檢測方法。

1.3統(tǒng)計學處理 本次研究中的所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，以P

2 結(jié)果

所有乙肝病毒患者血清樣本中前S1抗原呈現(xiàn)陽性的有76例，乙肝病毒e抗原呈現(xiàn)陽性的有61例，脫氧核糖核酸呈現(xiàn)陽性的有83例。其中乙肝病毒e抗原陽性61例患者中前S1抗原呈現(xiàn)陽性的有47例，陽性率為77.05%，脫氧核糖核酸呈現(xiàn)陽性的有50例，陽性率為81.97%，前S1抗原陽性率和脫氧核糖核酸陽性率比較，差異不明顯，P>0.05，不具有統(tǒng)計學意義。在脫氧核糖核酸呈現(xiàn)陽性的83例中，前S1抗原陽性72例，陽性率為86.75%，乙肝病毒e抗原呈現(xiàn)陽性的有48，陽性率為57.83%，前S1抗原陽性率和脫氧核糖核酸陽性率比較，有顯著差異P

3 討論

乙肝病毒的傳統(tǒng)途徑有血液、母乳喂養(yǎng)等，我國當前乙型肝炎的發(fā)病率非常的高，乙肝病毒成為危害我國人民健康的最為嚴重的一種病毒性肝炎。近幾年我國醫(yī)學界對乙型肝炎的研究取得較大的成就，對乙型肝炎病毒的研究主要是通過對乙型肝炎病毒患者的血清標志物、脫氧核糖核酸、乙肝病毒e抗原等進行檢測，在通過患者的臨床表現(xiàn)進行診斷[1]。以前采用的血清標志物檢測無法將乙型肝炎病毒在患者體內(nèi)的恢復(fù)情況進行反映，只能將乙型肝炎病毒在患者體內(nèi)的免疫狀態(tài)進行反映，無法將檢測結(jié)果作為患者的乙型肝炎診斷依據(jù)，而脫氧核糖核酸含量的檢測結(jié)果能作為乙型肝炎病毒傳染性的直接診斷依據(jù)，當前對乙型肝炎的研究得出前S1抗原和脫氧核糖核酸有密切的關(guān)系。在人體感染乙型肝炎病毒以后，首先受到影響的就是前S1抗原，所以對前S1抗原進行檢測，可以將人體的免疫狀況進行反映。

本次研究中100例乙肝患者的血清檢測，前S1抗原呈現(xiàn)陽性的有76例，乙肝病毒e抗原呈現(xiàn)陽性的有61例，脫氧核糖核酸呈現(xiàn)陽性的有83例。在61例乙肝病毒e抗原陽性患者中前S1抗原和脫氧核糖核酸的檢出率分別為77.05%，81.97%，而在83例脫氧核糖核酸陽性患者中乙肝病毒e抗原、前S1抗原檢出率為57.83%，86.75%。前者無統(tǒng)計學意義，后者P

由此我們可以得出前S1抗原在乙肝病毒傳染中起到一定的提示作用，和脫氧核糖核酸有相關(guān)性，而且這種相關(guān)性要高于和乙肝病毒e抗原之間的相關(guān)性，可以將乙肝病毒傳染強度進行反映。乙肝病毒前S1抗原可以作為乙肝病毒感染的臨床檢測指標，在臨床乙肝病毒診療中具有非常重要的應(yīng)用價值，可以將乙肝病毒前S1抗原檢測技術(shù)在臨床檢驗中廣泛使用[2]。

參考文獻：

第3篇：核酸檢測情況范文

現(xiàn)在去武漢需要做核酸檢測嗎12月 現(xiàn)在去武漢是不需要做核酸檢測的，但前提是你是低風險地區(qū)，畢竟按照抗疫規(guī)定全國低風險地區(qū)武漢憑健康碼綠碼、體溫正常即可通行，但是如果你是高風險地區(qū)的，全國中高風險地區(qū)來武漢地區(qū)，請主動到當?shù)厣鐓^(qū)進行申報并配合當?shù)匾咔榉揽刂笓]部的所有防控措施到指定地點隔離14天。隔離期間，將進行2次核酸檢測以及1次抗體檢測。

12月去武漢會被隔離嗎 12月去武漢不會被隔離，不過是低風險地區(qū)。

假使你是從中高風險區(qū)到達武漢，用不用核酸檢測、隔離，就要視武漢的防控措施來定，通常情況下，應(yīng)該給到7天核酸陰性證明就能通過，亦可能必須進行核酸檢測并隔離14天。假使你是從低風險區(qū)域去武漢，基本可以直接進入，不用進行核酸檢測和隔離。

12月去武漢要注意什么 1、任何時候來武漢旅游記得帶上雨具。當然，秋季雨水要少一點。

2、不要低估武漢的冷，即使東北來的也不要充大爺，武漢的冷可以整得你鼻青臉腫。

3、和其它城市一樣，盡量避開火車站的拉客，但你若感覺信心滿滿，試試也無妨。

第4篇：核酸檢測情況范文

2022五一學生出省回來要隔離嗎

如果學生去的是低風險地區(qū)，健康碼是綠碼，核酸是陰性，體溫正常，一般不需要隔離。

從中等和高風險地區(qū)返回時需要隔離，從省外低風險地區(qū)返回時不需要隔離，但需要進行核酸檢測。

對于從中高危地區(qū)返回的學生，需要進行14天的集中隔離。隔離期間，嚴格遵守觀察點規(guī)定，配合核酸檢測和健康監(jiān)護。

在家庭健康監(jiān)測期間，除非必要，否則不要外出，也不要參加任何聚會活動。對造成疫情傳播或者傳播風險的，依法追究責任。

2022五一學生出省需要做核酸嗎

一般都需要核酸檢測。

很多地方都有一些要求。例如，對于來自中高危地區(qū)的學生，教師應(yīng)進行核酸檢測和醫(yī)學觀察。對于來自低風險地區(qū)的學生來說，核酸檢測可能不是必需的。這還需要各地和學校根據(jù)當?shù)匾咔榉揽匾筮M行安排。

如果學校有特殊情況，比如突然發(fā)燒或其他身體異常，其他學生也可以戴口罩。如果出現(xiàn)突發(fā)疫情，應(yīng)緊急啟動應(yīng)急預(yù)案，并可能要求相關(guān)人員采取相應(yīng)的防控措施。首先要做的是戴口罩。

五一期間怎么做好防護

1.外出時，攜帶足夠的口罩、快干手消毒劑等個人防護用品，科學佩戴口罩，做好手衛(wèi)生。

2.盡量減少與公共交通工具上其他人的溝通，避免聚集，并盡可能與其他乘客保持距離。盡量避免直接接觸門把手、電梯按鈕等公共設(shè)施。接觸后及時洗手或用快干手消毒劑擦拭干凈。

第5篇：核酸檢測情況范文

  

  “電話發(fā)我！”短短四個字，讓“深圳衛(wèi)健委”的詞條迅速沖上了微博熱搜第一。

  事件起源于1月8日，深圳一位市民Prnliy在“深圳衛(wèi)健委”微信公眾號上留言求助：“昨晚9點在龍華中心醫(yī)院做的核酸，產(chǎn)婦等著住院要核酸證明才能入住，什么時候能出結(jié)果啊？12小時了。能不能優(yōu)先安排，因為真的挺急?！辈坏揭环昼妰?nèi)，深圳市衛(wèi)健委火速在留言區(qū)回復(fù)稱：“電話發(fā)我。”

  緊接著，經(jīng)過深圳市衛(wèi)健委、深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院、第三方檢測機構(gòu)爭分奪秒地協(xié)調(diào)和安排，一個半小時后，該市民收到了后方上傳的核酸檢測報告，而后孕婦也順利辦理了住院。

  網(wǎng)友紛紛點贊，并表示 “感動”“好感拉滿”“好酷，深圳速度”。有網(wǎng)友稱，這是 “2022年目前看到的最霸氣的四個字”。

  昨天下午，深圳市衛(wèi)健委宣教處處長王嶺向記者表示：“我們只是做了應(yīng)該做的。”

  【事件】

  不能入院!

  孕婦核酸檢測未出結(jié)果

  王嶺介紹，她作為深圳衛(wèi)健委公眾號的負責人，會時常關(guān)注后臺的留言信息，對于存在緊急情況的留言及時給予回復(fù)，并安排處理。

  1月8日上午10點57分，她在后臺收到一位市民求助稱：“昨晚（1月7日）9點在龍華中心醫(yī)院做的核酸，產(chǎn)婦等著住院要核酸證明才能入住，什么時候能出結(jié)果??？12小時了?！痹谠摿粞韵路剑貜?fù)了一句：“電話發(fā)我?！?/p>

  王嶺表示，要到留言的何先生電話以后，她把何先生反映的問題轉(zhuǎn)交龍華中心醫(yī)院進行處理。醫(yī)院相關(guān)負責人告訴王嶺：“昨晚的標本結(jié)果已出來，正在做上傳處理，但數(shù)據(jù)量大，還是有延遲?！?/p>

  1月8日11點17分，醫(yī)院門診部聯(lián)系何先生詢問采樣過程，并請他提供夫妻二人姓名與身份證號碼。醫(yī)院查詢后發(fā)現(xiàn)，何先生提供的信息在醫(yī)院未查詢到結(jié)果。何先生稱，采樣地點是在“大門進來左邊往中醫(yī)科那條路”。

  醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，何先生所說的是一個醫(yī)院設(shè)置的臨時采樣點，采樣后標本被送到第三方檢測機構(gòu)。而醫(yī)院為入院患者專門設(shè)置了采樣點，都是由醫(yī)院自己實驗室檢測的。于是王嶺又問詢第三方檢測機構(gòu)，得到回復(fù)稱：“結(jié)果已出，但因人手不足未經(jīng)審核，馬上審核?！?/p>

  當天12點28分，何先生及愛人的核酸檢測報告被上傳到系統(tǒng)。王嶺立即將消息發(fā)給何先生，并收到何先生的回復(fù)短信：“好的，已收到。感謝?！?/p>

  【結(jié)果】

  “電話發(fā)我”!

  霸氣回復(fù)顯速度更顯溫度

  截至1月9日10時許，深圳市衛(wèi)健委這則簡短回復(fù)已收獲2萬多次點贊，話題閱讀量已高達2.8億。

  對此，有網(wǎng)友表示：“電話發(fā)我”彰顯霸總氣場，并廣為流傳?！半娫挵l(fā)我，2022年目前看到最霸氣的四個字”……

  昨天下午，何先生向記者證實了此事，新華社也對他進行了采訪。

  何先生表示，夫妻倆來深圳4年多，這是他們的第一個寶寶。留言求助之后，很快就接到了來自龍華中心醫(yī)院的電話并查到了核酸結(jié)果，粵康碼也出來了，他的太太順利入住了醫(yī)院。目前孕婦的情況穩(wěn)定，正在深圳市中醫(yī)院進一步治療。

  “感謝深圳市衛(wèi)健委及時幫忙聯(lián)系了做核酸的醫(yī)院錄入了結(jié)果，（我們）順利辦理了入院?！?月8日，何先生在微博上留言透露，他愛人懷孕8周左右，應(yīng)該是孕婦，不是產(chǎn)婦，但情況還不穩(wěn)定，醫(yī)院建議住院觀察治療，當時他在“深圳衛(wèi)健委”微信公眾號留言是想加快核酸錄入?！跋Ｍ麑殞殘詮娊】盗粝聛?，以后也去‘深圳衛(wèi)健委’當小編?！?/p>

  王嶺稱，目前深圳市正在進行大規(guī)模核酸檢測，無論是單方個人采集還是集體采集，報告結(jié)果出來的時間可能會較平時稍有延遲，“我們作為官方公號后臺與市民有直接聯(lián)系的渠道，如果遇到緊急情況，當然也要緊急處理，回復(fù)也好，協(xié)調(diào)也好，我們也只是按照國家要求做了應(yīng)該做的?！?/p>

  【專訪】

  應(yīng)該做的!

  服務(wù)型政府就是服務(wù)民眾

  對于深圳市衛(wèi)健委的這一處理方式，網(wǎng)友們紛紛點贊。

  “深圳市政府是服務(wù)型政府，簡單來說就是服務(wù)民眾。當時我們沒有想那么多，只想著盡快幫助市民解決問題就好?！?月9日，深圳市衛(wèi)健委宣教處處長王嶺接受采訪時表示。

  王嶺介紹，根據(jù)國務(wù)院副總理的講話，深圳市召開了疫情防控新聞會，提出了統(tǒng)籌做好疫情防控和就醫(yī)服務(wù)保障工作，督促各類醫(yī)療機構(gòu)不能以任何借口推諉拒收患者，對透析患者、放化療等腫瘤患者以及孕產(chǎn)婦、新生兒等急需就醫(yī)的，建立24小時值班值守制度，確保就診救治需求得到充分保障。

  在接受記者采訪時，王嶺回顧了此事的經(jīng)過，“深圳衛(wèi)健委”微信公眾號有1400萬粉絲，平時收到很多網(wǎng)友留言求助，8日上午，她看到這一單求助比較緊急，就馬上回復(fù)網(wǎng)友：“電話發(fā)我?！蹦玫诫娫捯院?，她直接發(fā)給了醫(yī)院方面，敦促落實處理。

  從市民發(fā)出求助，到事情順利解決，前后花了不到兩個小時。

  “深圳人比較務(wù)實，沒有太多道理可以講。對我來說，就是發(fā)了個電話給醫(yī)院，督促醫(yī)院落實。后面主要是醫(yī)院在處理，行動力很強?！蓖鯉X告訴記者。

  王嶺表示，后續(xù)深圳衛(wèi)健委將會繼續(xù)認真做好封控管控區(qū)域的生活保障工作，充分運用此前社區(qū)小區(qū)防控保障經(jīng)驗，組建專門服務(wù)保障團隊，開通專門熱線電話，認真做好糧食蔬菜、口罩等基本生活物資和防疫物資保障工作，對隔離人員中的“老幼病殘孕”特殊人群，將建立“一對一”或“一對多”服務(wù)機制，加強心理疏導和人文關(guān)懷，特別是將統(tǒng)籌做好疫情防控和就醫(yī)服務(wù)保障工作，督促各類醫(yī)療機構(gòu)不能以任何借口推諉拒收患者，對透析患者、放化療等腫瘤患者以及孕產(chǎn)婦、新生兒等急需就醫(yī)的，建立24小時值班值守制度，確保就診救治需求得到充分保障。

  【經(jīng)過】

  1月8日上午10:57，“深圳衛(wèi)健委”微信公眾號后臺收到市民求助，要到市民電話以后，轉(zhuǎn)交深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院進行處理。

  11:17，醫(yī)院門診部根據(jù)截圖中市民Prnliy在10:57發(fā)到公眾號留言中的電話號碼，與市民Prnliy聯(lián)系上，問詢采樣的過程，并請Prnliy提供姓名與身份證號碼。

  11:20，市民Prnliy發(fā)來兩個身份證號碼，在醫(yī)院未查詢到結(jié)果。

  12:07，市民短信提示采樣點是“在大門進來左邊往中醫(yī)科那條路”（指的是醫(yī)院核酸采樣點旁邊的臨時采樣點）。醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，這是一個醫(yī)院設(shè)置的臨時采樣點，并非醫(yī)院為入院患者專門設(shè)置的采樣點，采樣后標本被送到第三方檢測機構(gòu)。入院患者的都是由醫(yī)院自己實驗室檢測的。

  12:26，問詢第三方檢測機構(gòu)回復(fù)：“結(jié)果已出，但因人手不足未經(jīng)審核，馬上審核?！?/p>

第6篇：核酸檢測情況范文

關(guān)鍵詞：諾如病毒；PCR；食源性疾病；檢測技術(shù)

Abstract：Objective A laboratory investigation and analysis of school outbreaks of acute gastroenteritis caused by Norovirus was performed. Methods The method combined epidemiological investigation with laboratory testing was employed. A total of 40 samples includingswabs and feces of patients； food； condiments； smear samples of environment samples ； water samples were collected and utilized for RT-PCR detection and routine bacteriological testing. Results Norovirus nucleic acid were detected positive inswabs of six students， a health care teacher， three chefs and a feces sample， a food. Conclusion Norovirus inswab， feces and food can be detected quickly and effectively by RT-PCR.

Key words：Norovirus；PCR；Foodborne diseases；Detection technology

近年來，諾如病毒引起的急性胃腸炎暴發(fā)時有發(fā)生。諾如病毒可通過食物、水及人與人接觸而使人感染發(fā)病，若在學校及幼兒園等集體單位發(fā)生，則易引起群體性胃腸炎暴發(fā)。諾如病毒感染性腹瀉以起病急、傳播快、暴發(fā)多為特征，因該病的癥狀及其多在冬季流行率上升，故被稱為"胃腸道流感"或"冬季嘔吐病"[1]。本文針對2015年3月成都市成華區(qū)某小學發(fā)生的一起諾如病毒引起的聚集性急性胃腸炎，將相關(guān)實驗室病原檢測情況及技術(shù)探討報告如下：

1 資料與方法

1.1臨床信息 學生聚集性病例的主要癥狀為嘔吐、腹瀉、腹痛、惡心，部分病例的血常規(guī)檢測結(jié)果顯示白細胞總數(shù)、中性粒細胞率增高。

1.2流行病學及衛(wèi)生學調(diào)查 患者均為在校學生及教師，有在校共同進餐史，學校提供公用直飲水及生活用水。

1.3 樣本采集及其來源 根據(jù)流行病學信息，準備的采樣物資包括病毒采樣管（北京友康）、自配滅菌1% NaCl肉湯、滅菌鹽水和腸道致病菌直劃平板（Mac、HE、TCBS）。采集病例肛拭8份、糞便樣1份、學校廚師肛拭8份、供餐食品留樣5份、調(diào)味品4份、環(huán)境涂抹樣16份及水樣2份（見表1）。

1.4實驗室檢測 對采集的樣本進行病毒學檢測和食物中毒常規(guī)致病菌檢測。用RT-PCR法檢測諾如病毒和輪狀病毒核酸；采用RT-PCR和細菌培養(yǎng)法檢測食物中毒常規(guī)致病菌：沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、致瀉大腸埃希氏菌。

1.4.1 病毒檢測樣本處理 肛拭和糞便樣本無需前處理；對于食品樣本，采用無菌操作取適量（約5 g）樣本至病毒采樣管內(nèi)（若有體積較大的食材，則用滅菌剪刀剪碎后放入），充分振搖后，靜置待用。

1.4.2 細菌DNA 的提取及檢測 取樣本鹽水管上清液1mL，12000rpm離心5min后棄上清。沉淀加入滅菌水50μL，將其懸浮后100℃煮沸5min，12000rpm離心2min，取上清用于PCR反應(yīng)。本實驗采用達安生物科技有限公司提供的沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、致瀉大腸埃希氏菌核酸檢測試劑盒，按說明書加入5μL核酸提取物，在ABi Step-one plus PCR擴增儀依程序進行40次循環(huán)擴增，并檢測。

1.4.3病毒RNA 的提取及檢測 選用天隆核酸提取試劑盒（磁珠法）（Ex-RNA/DNA 病毒2.0）提取病毒RNA。取各樣本上清液200μL，按說明書加入10μL Proteinase K，4μL Acryl Carrier，放入天隆NP 968核酸提取儀依程序自動提取。RT-PCR采用達安生物科技有限公司的A、B、C 組輪狀病毒核酸、諾如病毒核酸檢測試劑盒，取核酸提取物5μL，加入PCR反應(yīng)管，放入ABi Step-one plus PCR擴增儀依程序擴增40個循環(huán)，并檢測。

1.4.4 細菌學培養(yǎng)法常規(guī)檢測 按照WS 271-2007、GB 4789-2010方法進行沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、致瀉大腸埃希氏菌、變形桿菌、椰毒假單胞菌等病原菌的檢測。

2結(jié)果

2.1細菌PCR檢測 擴增曲線均無明顯指數(shù)增長期和平臺期，表明樣本中未檢出目標菌核酸。

2.2病毒RT-PCR檢測 RT-PCR結(jié)果表明，6名學生、1名保健教師、3名食堂廚師的肛拭樣本和1個糞便樣本、1個食品樣本（炒榨菜）中檢出諾如病毒；所有樣本中均未檢出輪狀病毒（見表2）。

注：打"/"號為該樣品未開展檢測此項檢測。

2.3細菌學培養(yǎng) 細菌學培養(yǎng)結(jié)果顯示，樣本均未檢出目標菌。

2.4疫情控制 臨床資料、流行病學調(diào)查資料和實驗室檢測結(jié)果顯示，從食品加工者、食品及用餐者檢測出諾如病毒，構(gòu)成一條出清晰的傳播鏈。因此，此次疫情判定為諾如病毒引起的聚集性疫情，可能系諾如病毒污染學校供餐食品所致。明確診斷和進行疫情分析后，疾控中心繼續(xù)開展調(diào)查，指導并督促學校落實疫情控制措施，停止食用污染的食品，對相關(guān)區(qū)域進行了消毒，對帶病毒廚師調(diào)離食品加工崗位，繼續(xù)開展癥狀監(jiān)測、病例搜索等防控措施。對住院病例進行有針對性治療。截止疫情發(fā)生后第3d，住院病例相繼痊愈出院，未發(fā)現(xiàn)新發(fā)病例，疫情得到有效控制。

3 討論

3.1在17例病例的臨床檢驗結(jié)果中，有5例血常規(guī)檢測結(jié)果顯示中性粒細胞率增高，淋巴細胞率降低，部分患者白細胞總數(shù)增高。一般情況，接診醫(yī)院會做出胃腸道細菌型感染診斷，但檢測實驗室不應(yīng)輕易排除對病毒的采樣、檢測。

3.2此次事件共采集了40個樣本，包括肛拭、糞便、食品、調(diào)味品、環(huán)境涂抹樣、水樣等不同的樣本類型，樣本容器包括病毒采樣管、1% NaCl肉湯采樣管、滅菌鹽水采樣管和Mac、HE、TCBS致病菌直劃平板。科學、適度、合理的采集樣本可提高病原微生物的檢出率。

3.3諾如病毒的檢測目前主要采用RT-PCR 技術(shù)，國內(nèi)食品類檢測研究僅限于牡蠣等貝類樣本， 尚未見蔬菜、水果等其他食品的病毒檢測方法報道。另外，食品樣本一般體積大，病毒含量少，樣本處理、病毒富集是實驗室檢測的關(guān)鍵點，也是難點。一般采用有機絮凝沉淀法進行富集[3]。但無論是PEG沉淀法，還是Trizol抽提法，過程都比較繁瑣、用時長，加之多數(shù)基層疾控中心現(xiàn)階段并未配備相關(guān)設(shè)備和耗材，因此無法進行病毒富集。在此次檢測中，我們根據(jù)經(jīng)驗判斷病毒含量可能比較大，所以采用均質(zhì)后靜置，取上清液直接進行檢測，結(jié)果顯示多個樣本諾如病毒陽性。這表明在樣本數(shù)量足夠、污染病毒量大且成分單一的情況下，本方法對于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測有一定的可行性。

3.4 與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，PCR技術(shù)用于病原微生物檢測具有靈敏、快速、檢出率高等優(yōu)勢。目前，該技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛。此次采用PCR法檢出以諾如病毒為代表的腸道致瀉病毒，為聚集性胃腸炎的病因診斷提供了有力證據(jù)。

3.5對于基層疾控中心來說，病原微生物的富集、檢測等基礎(chǔ)設(shè)備設(shè)施的匱乏給檢測帶來了一定的難度，特別是中西部地區(qū)的基層疾控中心應(yīng)加強檢測能力的建設(shè)。

參考文獻：

[1] GUREMONT E，BRASSARD J，HOUDE A，et al.Development of an extraction and concentration procedure and comparison of RT-PCR primer systems for the detection of hepatitis A virus and norovirus GII in green onions[J].J Virol Meth， 2006， 134（1-2）：130-135 .

第7篇：核酸檢測情況范文

1免疫學的方法

在食品微生物的檢測當中免疫學技術(shù)主要是建立在抗原、抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)基礎(chǔ)上,并且以免疫放大技術(shù)為輔,利用病原體刺激生成免疫球蛋白。這種方法的優(yōu)勢在于不需要進行樣品選擇性增菌之后分離,就可直接進行篩選,具備了靈敏度高的特點,按照檢測方法的差異可以分為凝集反應(yīng)、免疫擴散反應(yīng)和免疫熒光反應(yīng)等。

1.1凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)從本質(zhì)上來講也是利用抗原、抗體相結(jié)合的原理,將特異性抗體包被于乳膠顆粒之上,進而產(chǎn)生了肉眼可見、便于觀察的凝集反應(yīng)。這種方法因其特異性需要獲得較純的細菌培養(yǎng)物,然后使培養(yǎng)物和致敏乳膠發(fā)生反應(yīng),通常應(yīng)用于大腸桿菌類細菌中H7和O157的鑒定。

1.2免疫擴散反應(yīng)免疫擴散反應(yīng)的本質(zhì)是生成一種不溶性的抗原、抗體復(fù)合物,是將抗體放入固體或者液體的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),生成一種肉眼可見的沉淀性物質(zhì),這種反應(yīng)需要在特定培養(yǎng)基中進行,在實際的食品微生物檢測方法中,應(yīng)用了這一技術(shù)的有VIP免疫擴散的試劑條還有Salmonella1-2的TestTM,這一類產(chǎn)品在實際當中應(yīng)用也頗為廣泛。

1.3免疫熒光反應(yīng)免疫熒光學反應(yīng)的本質(zhì)是一種免疫學標記技術(shù),利用熒光素對檢測抗原或者抗體進行標記,而后產(chǎn)生的特異性抗原反應(yīng)能夠形成帶有熒光的抗原、抗體結(jié)合物,在儀器中得到檢驗。這種方法在實際應(yīng)用的過程中按情況不同可以分為直接方法和間接方法。直接方法就是直接在檢測的樣品上滴加已知特異性的熒光標記抗血清,在洗滌之后進行觀察。間接方法就是將細菌特異性抗體上滴加在檢測樣本上,經(jīng)過反應(yīng)后再洗滌,然后加入熒光標記第二抗體,實現(xiàn)檢測。這種方法因其熒光性更加有利于觀察,也因其特異性主要適用于沙門氏菌、葡萄球菌、李斯特菌以及單核細胞增生的李斯特氏菌等方面的檢測。

2分子生物學法

2.1聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)是一種體外的選擇性DNA或RNA擴增技術(shù)。其根本目的就是將人工無法培養(yǎng)出的微生物進行相應(yīng)DNA或者RNA的片段擴增,通過檢測擴增產(chǎn)物的含量來快速檢測飼料當中存在的致病菌含量。聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)簡稱為PCR,可以直接對樣品當中的肉毒梭菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和痢疾桿菌進行檢測,PCR能夠克服核酸定量敏感性低的缺點,分析出極為微量的DNA,對任何模板的標本都能夠?qū)崿F(xiàn)定量擴增及分析。聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)克服了基因探針技術(shù)靈敏度不高的缺陷,其中引入的Taq聚合酶還能夠簡化反應(yīng)程序,實現(xiàn)半自動化。以同位素標記基因探針的PCR反應(yīng)為例,這種方法應(yīng)用于水源E.Coli的檢測,能夠使檢測量達到100%,能夠快速檢驗出食品當中帶有污染的病原,并能夠保證其準確性。美國杜邦快利康公司已經(jīng)建立了BAX+病原菌的檢測系統(tǒng),PCR技術(shù)在細菌檢測方面的應(yīng)用前景十分廣闊。

2.2核酸探針技術(shù)核酸探針本身是一種帶標記的DNA特異性片段,核酸探針技術(shù)的原理是利用堿基互補的原則,使核酸探針和目的DNA進行雜交,最終以特定方法進行標記物測定,核算探針技術(shù)大致可以分為非放射性標記和放射性標記兩大類。核酸探針具有特異性。傳統(tǒng)的檢測方法都是以基因表達產(chǎn)物為檢測目標,會受到多種因素的干擾,檢測病毒要在組織培養(yǎng)之后對蛋白質(zhì)的囊膜進行檢測,還須采取超低溫的保存技術(shù),但仍然會因其一些編碼蛋白的基因變化,核算探針則避免了這一復(fù)雜的程序,無需改變目的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),更方便應(yīng)用。但是要注意這其中要將RNA除外,因為RNA探針不耐受堿處理,需要采取不同的方法來制備出檢測用的RNA。核酸探針特異性主要取決于使用條件和堿基序列,還會受到探針長度的影響,其敏感性主要受標記系統(tǒng)和探針本身的控制,延長培養(yǎng)的時間也能夠提高探針靈敏度。在當前的核酸探針應(yīng)用過程中還存在一些問題,要實現(xiàn)更快更簡潔的制備還需要一段時間的研究和探討,逐步克服因待檢菌種繁多而產(chǎn)生的核酸探針制備問題,突破局限性。

3結(jié)語

第8篇：核酸檢測情況范文

【關(guān)鍵詞】乙肝；病毒感染；血清；乳汁；核酸檢測；病毒檢測

乙肝是我國常見的傳染性疾病，母嬰途徑是其重要的傳播方式。作為嬰兒最為理想的食物，母乳是否具有傳播乙肝病毒的作用目前還存在著一定的爭議，有研究認為約有（30-50）%的乙肝病毒慢性攜帶者由母嬰途徑引起［1］。本研究通過對92例血清HBV-Ag陽性的孕產(chǎn)婦血清及乳汁病毒核酸進行檢測和分析，現(xiàn)報告如下：

1資料與方法

1.1臨床資料選取2007年1月-2011年11月期間我院收治的乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦92例，年齡（28-43）歲，平均（29.17±3.82）歲；孕（37-41）周，平均（39.16±0.42）周。所有孕產(chǎn)婦均為單胎妊娠，且為第一次妊娠。胎兒體重（2100-4500）g，平均（3273.73±637.26）g。所有產(chǎn)婦均未見明顯的臨床癥狀，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（0-40）U/L。采用Child-pugh法對肝功能進行分級［2］，A級13例，B級39例，C級40例。剖宮產(chǎn)37例，自然分娩53例，陰道助產(chǎn)2例。

1.2方法采用ELISA檢測法對產(chǎn)婦血清及乳汁中乙肝標志物進行測定，并采用熒光定量多聚酶鏈式反應(yīng)法對血清以及乳汁中的HBV-DNA含量進行測定。于產(chǎn)婦分娩前采取清晨空腹外周血3ml，放置10min后以6000r/min進行離心10min。取50ul放入Eppendorf管，并加入50ulDNA提取液充分打勻，放入100℃干式恒溫器10min，然后進行10min離心，轉(zhuǎn)速為10000r/min。取5ul行PCR檢測。產(chǎn)婦分娩3d后收集3ml初乳，以10000r/min進行離心10min，去除上層油脂后吸取100ul下層乳汁放入無菌微量離心管，加入100ul100g/L聚乙二醇液混勻，并在4℃下進行10000r/min離心15min，拋棄上清液。加入50ul滅菌雙蒸水，將沉淀進行充分溶解，并加入DNA提取液，充分混勻。將上述標本放置于冰箱以4℃冷藏過夜，然后吸取750ul乳汁注入Eppendorf管進行ELISA檢測和HBV-DNA定量檢測。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，且以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1ELISA檢測結(jié)果92例患者中大三陽24例（26.09%），小三陽36例（39.13%），HBsAg以及HBcAb陽性32例（34.78%）。

2.2HBV-DNA檢測各組患者乳汁HBV-DNA陽性率均低于血清檢出率，但是差別并不明顯（P＞0.05）。大三陽組患者血清、乳汁HBV-DNA檢出率明顯高于其他兩組，且其病毒載量明顯高于其他兩組（P＜0.05）。且隨著血清病毒載量的升高，乳汁病毒載量也相應(yīng)升高，兩者成正相關(guān)（r=0.853，P＜0.05），見表1。

3討論

乙型肝炎是一種嚴重危害人類健康的全球性疾病，在我國乙肝病毒攜帶率高達（10-15）%，每年更是有超過百萬的乙肝病毒攜帶者分娩，母嬰傳播是乙肝病毒進行傳播的重要途徑。母乳中不僅富含優(yōu)質(zhì)蛋白、乳糖、維生素以及飽和脂肪酸，而且可以有效提高嬰兒抵抗力，促進其健康成長［3］。但是乙肝表面抗原陽性產(chǎn)婦是否可以進行母乳喂養(yǎng)一直以來都存在著較大的爭議。

乙肝病毒核酸是病毒具有傳染性的最為直接的標志，其拷貝數(shù)量直接衡量著傳染性的強弱，也是衡量治療效果的重要指標［4］。本研究中乳汁HBV-DNA的檢出率略低于血清，但是差異并不明顯。大三陽患者血清以及乳汁病毒核酸載量明顯高于其他患者，且乳汁病毒核酸載量隨著血清載量的升高而升高。這些都說明，乙肝病毒攜帶患者其體內(nèi)HBV仍然處于較為活躍的復(fù)制期，在這種情況下，產(chǎn)婦進行母乳喂養(yǎng)應(yīng)各位謹慎。條件允許時可以對血清以及乳汁中病毒核酸進行檢測以確定喂養(yǎng)方式，如果條件不允許，則應(yīng)放棄母乳喂養(yǎng)。

參考文獻

［1］曾定元，莫可良，賀紅英，等.聯(lián)合免疫后乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦母乳喂養(yǎng)安全性的探討［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2006，18（2）：125-127.

［2］刑榮春，鄭軍，肖建華.Child-Pugh分級的發(fā)展及臨床應(yīng)用［J］.山東醫(yī)藥，2011，55（52）：114-115.

第9篇：核酸檢測情況范文

摘要在CIK細胞的培養(yǎng)過程中加入卡介菌多糖核酸，研究其對CIK細胞體外增殖及殺瘤活性等方面的影響.CCK8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度卡介菌多糖核酸處理的CIK細胞相比對照組（生理鹽水），細胞增殖能力和殺瘤效果都顯著上調(diào).RTqPCR結(jié)果顯示卡介菌多糖核酸處理后的CIK細胞毒活性相關(guān)因子（Granzyme B， IFNγ， TNFα和TNFβ）mRNA的表達相比對照組都有提高.這些結(jié)果可為培養(yǎng)具有更高效殺瘤活性又能大量擴增的CIK細胞提供新思路.

關(guān)鍵詞卡介菌多糖核酸；CIK；細胞增值；殺瘤活性

中圖分類號Q78文獻標識碼A文章編號10002537（2017）02003306

The Impact of BCGPSN on the Activity of CIK Cells

HUANG Zhaoqin1， SU Renxiang1， ZHONG Beifen1， HAN Huimin2， GU Zhixin2， YAN Donglan2， XIN Xiu2， YUAN Li2， HU Xiang1，2*

（1.Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of State Education Ministry of China，

College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China；

2.Jiuzhitang Limited Share Company Postdoctoral Workstation， Changsha 410205， China）

AbstractThe BCG polysaccharide and nucleic acid （BCGPSN） was added to CIK cells to study CIK cells responses on the proliferation and tumoricidal activity in vitro. CCK8 results showed that the CIK cells treated with low dose BCGPSN， compared with control group （normal saline）， were significantly enhanced on the proliferation and tumoricidal activity. RTqPCR results revealed that the expression of CIK Granzyme B， IFNγ， TNFα， TNFβ mRNA of BCGPSN group was higher than that of the control group. These results lay the foundation for how to cultivate a large number of CIK cells with high tumoricidal activity， and provide new ideas for the therapy of antitumor adoptive immunity.

Key wordsBCGPSN； CIK cell； cell proliferation；tumoricidal activity

盒災(zāi)琢鲅現(xiàn)匚：θ死嘟】擔目前常規(guī)的手術(shù)和放化療治療方法均不能徹底清除體內(nèi)的瘤細胞，過繼免疫治療法因具有符合生理、低毒和高效等優(yōu)點成為重要的腫瘤輔助治療手段[1].其中，細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokineinduced killer cells， CIK細胞）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非常有前景的過繼免疫細胞，具有增殖迅速、殺瘤活性廣譜且高效、毒副作用微小等優(yōu)點，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一種新選擇[24].CIK是以CD3+CD56+ T細胞為主的異質(zhì)細胞群，兼有 NK 細胞和 T 細胞的特征.在功能上，CIK 一方面擁有 T 淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，另一方面還擁有 NK 細胞非 MHC 限制性的殺傷腫瘤的特點，其增殖迅速、對正常造血影響輕微[5].CIK細胞的增殖和細胞毒活性依賴于多種外源性細胞因子的刺激，但何種因子組合為最佳尚無定論，因此研究如何進一步提高CIK的增殖和殺瘤活性已經(jīng)成為抗腫瘤的過繼免疫細胞生物治療的一個熱點[6].

卡介菌多糖核酸（BCG polysaecharide and nucleis acid，BCGPSN）是在卡介苗的基礎(chǔ)上，通過熱酚法提取卡介菌中的多糖、核酸，混合而制成的免疫活性物質(zhì)，是我國首創(chuàng)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型免疫調(diào)節(jié)劑[78].BCGPSN 能誘導多種免疫細胞的活化，調(diào)節(jié)多種細胞因子的分泌，可作為一種較好的腫瘤輔助治療手段[9].

由于卡介菌多糖核酸能提高機體免疫力并且輔助提高腫瘤治療效果，同時CIK細胞亦是腫瘤過繼免疫治療的有效方法，且國內(nèi)外還沒有BCGPSN聯(lián)合CIK進行研究的相關(guān)報道，因此本課題將兩者結(jié)合起來研究.為研究卡介菌多糖核酸的生物活性及藥理作用，在CIK細胞的培養(yǎng)過程中加入卡介菌多糖核酸，研究其對CIK細胞的體外增殖及對肝癌細胞的毒活性（殺瘤活性）方面的影響，并且探討其對CIK細胞毒活性相關(guān)因子表達的影響.

1.材料與方法

1.1材料

淋巴細胞分離自健康志愿者外周血.SMMC7721肝癌細胞系于上海中科院購買，本實驗室長期保存.斯奇康卡介菌多糖核酸注射液（1 mL/支）購自湖南九芝堂制藥公司.人血液淋巴細胞分離液購自佳和生物.采血針、采血管、生理鹽水購自長沙市第四人民醫(yī)院.人源CD3單抗購自北京同立源生物科技有限公司，人白介素（IL2）買自江蘇金絲利藥業(yè)有限公司.DMEM培養(yǎng)液、RPMI1640和GTT551培養(yǎng)液，以及胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品.青霉素鏈霉素溶液產(chǎn)自碧云天.

1.2方法

1.2.1CIK細胞分離及原代培養(yǎng)采集健康志愿者血液20 mL，平衡溫度至室溫.取50 mL離心管若干，將血樣轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋至30 mL，充分吹打均勻.將稀釋后的血樣緩緩加入另一管裝有15 mL 淋巴細胞分離液的上方，形成上下兩相.22 ℃，390 g離心30 min（加速1，剎車0）.離心后血漿層與分離液之間有白膜層可見，分別收集上層血漿和中間白膜層至新的離心管.于收集白膜層的離心管中加入RPMI1640至45 mL，混勻，22 ℃，1 000 g離心10 min（加速9，剎車9）.重復(fù)上一步驟兩次，離心速度分別改為400 g和201 g，最后一次離心之前取20 μL混勻的細胞懸液進行臺盼藍染色計數(shù)，參照《細胞計數(shù)SOP》.離心后重懸細胞，按細胞數(shù)5×106個/mL加含有500 μg/L CD3 mAB， 1 000 U/mL IL2和10%FBS的GTT551培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)成CIK細胞.

1.2.2腫瘤細胞培養(yǎng)在37 ℃，5%CO2及90%相對濕度的細胞培養(yǎng)箱中用DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和100 mg/L青鏈霉素溶液）培養(yǎng)SMMC7721細胞.

1.2.3CCK8 檢測細胞增殖活力將培養(yǎng)7 d的CIK細胞數(shù)調(diào)整至2×106 個/mL，于96 孔平底細胞培養(yǎng)板每孔加入細胞懸液50 μL，設(shè)實驗組和對照組，對照組為生理鹽水組，實驗組分為5組，分別加入卡介菌多糖核酸終濃度為1，10，50，100，200 mL/L的培養(yǎng)基各50 μL，每個濃度4個平行對照孔，置于細胞培養(yǎng)箱中處理細胞72 h，加入10 μL CCK8溶液，4 h 后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD450值A(chǔ)（吸光度的大小與活細胞的數(shù)量呈正比）.并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析.以BCGPSN 濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，作細胞增殖曲線.

1.2.4腫瘤殺傷實驗將培養(yǎng)9 d的CIK細胞均分為兩組，分別為對照組和實驗組，對照組為生理鹽水組，實驗組為培養(yǎng)基終濃度為10 mL/L的卡介菌多糖核酸，置于細胞培養(yǎng)箱中處理細胞72 h（至12 d）.另外，在CIK細胞培養(yǎng)11 d時，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SMMC7721細胞調(diào)整細胞密度為1×105 個/mL，于96孔板中鋪板每孔100 μL細胞懸液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.CIK培養(yǎng)至第12天進行CIK殺傷腫瘤細胞實驗，棄去SMMC7721舊的培養(yǎng)液，分別按n（效應(yīng)細胞）/n（靶細胞）為5∶1，10∶1和20∶1調(diào)整兩組CIK細胞至相應(yīng)數(shù)目加入SMMC7721細胞孔中，每個比例3個復(fù)孔，同時設(shè)單獨靶細胞和單獨效應(yīng)細胞對照組，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h. 4 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標儀測定OD450值A(chǔ).計算殺傷率：殺傷率（%）=[1-（實驗組A值-單獨效應(yīng)細胞組A值）/單獨靶細胞組A值]×100%.

1.2.5細胞總RNA的提取及cDNA的合成

（1）卡介菌多糖核酸處理CIK細胞：調(diào)整培養(yǎng)至第9天的CIK細胞數(shù)目至2×106 個/mL，于6 孔平底細胞培養(yǎng)板每孔加入細胞懸液1 mL，設(shè)實驗組和對照組，實驗組加入卡介菌多糖核酸終濃度為10 mL/L的培養(yǎng)基1 mL，對照組加入生理鹽水，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.

（2）RNA提取及反D錄：按TRIZOL法提取CIK細胞總RNA，按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

1.2.6實時定量PCR

（1）引物的設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank中基因的序列，查找文獻并用Primer Primer 5 軟件設(shè)計CIK相關(guān)毒活性因子Granzyme B，TNFα，TNFβ，IFNγ，Actin（內(nèi)參）基因引物（見表1）.將設(shè)計好的目的引物序列發(fā)給上海生工公司合成.

（2）引物驗證：引物合成后，加入滅菌水溶解至10 μmol/L.先做一個普通PCR檢測引物是否能克隆出目的片段，PCR反應(yīng)體系如表2，按照體積從大到小加溶液至總體積為20 μL.

PCR體系加完后用槍輕輕混勻，放入PCR儀擴增片段.擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)29個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min.用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應(yīng)完成后產(chǎn)物.

（3）熒光定量PCR：反應(yīng)體系見表3，共30 μL，具體操作按照Takara SYBR RTqPCR產(chǎn)品說明書進行.

1.2.7統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件及Graphpad軟件進行方差及顯著性分析，檢驗水準（P）設(shè)為0.05.

2結(jié)果與分析

2.1CIK細胞形態(tài)觀察

CIK細胞即細胞因子誘導的殺傷細胞，它是從人血液分離出來的單核淋巴細胞經(jīng)IL2和CD3單抗等細胞因子誘導培養(yǎng)產(chǎn)生的以CD3+CD56+ T細胞為主的異質(zhì)細胞群.CIK是一種懸浮細胞，相比癌細胞其體積較小.經(jīng)過適應(yīng)期的CIK細胞隨著培養(yǎng)時間延長，細胞數(shù)量對數(shù)生長且會形成細胞球，細胞體積在7～12 d時有所增大，之后幾乎不變.圖1是顯微鏡下不同時期的CIK細胞形態(tài)，A～D分別對應(yīng)從人血中分離后培養(yǎng)至1，4，7，11 d的CIK細胞.

2.2卡介菌多糖核酸對CIK細胞增殖的影響

在CIK細胞培養(yǎng)至第7天時，加入不同濃度的卡介菌多糖核酸處理細胞72 h，然后用CCK8試劑盒檢測CIK細胞活性.分析數(shù)據(jù)結(jié)果，以不同BCGPSN濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作量效曲線圖，結(jié)果如圖2所示.由圖可知，隨著BCGPSN濃度的增加，吸光度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在BCGPSN濃度增加到10 mL/L時，CIK活細胞數(shù)目最多，吸光度最大且明顯高于未加藥組，統(tǒng)計分析差異有意義（*p

2.3卡介菌多糖核酸對CIK細胞殺傷活性的影響

為了驗證卡介菌多糖核酸對CIK細胞殺瘤活性有影響，筆者將培養(yǎng)至第9天的CIK細胞加入卡介菌多糖核酸處理72 h（至12 d），再進行CIK殺傷SMMC7721腫瘤細胞實驗.殺傷率統(tǒng)計結(jié)果如圖3.結(jié)果顯示，無論是實驗組還是對照組，隨著效靶比增大CIK細胞殺傷腫瘤效果增強；相比對照組，實驗組CIK細胞在效靶比為5∶1和10∶1時殺傷率有顯著提高（*p

2.4BCGPSN對CIK細胞毒活性相關(guān)因子RNA表達的影響

收集生理鹽水和10 mL/L的卡介菌多糖核酸處理72 h的兩組CIK細胞，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，做熒光定量PCR檢測CIK細胞毒活性相關(guān)因子的表達.瓊脂糖凝膠電泳檢測CIK細胞RNA質(zhì)量，可看到28S和18S兩條清晰的帶，如圖4.RTqPCR結(jié)果顯示BCGPSN實驗組CIK細胞Granzyme B（顆粒酶B），TNFα，TNFβ的mRNA表達量較對照組明顯升高（*p

Mark：DNA standard marker；1：對照組CIK細胞RNA；2：BCGPSN實驗組CIK細胞RNA.

3討論

卡介菌多糖核酸是從卡介菌中提取的核酸、多糖等活性物質(zhì)混合而成的免疫增強劑，具有調(diào)節(jié)機體免疫水平、增強機體抗感染和抗過敏的能力[10]，還可促進T 淋巴細胞的增殖與活化及輔助提高機體內(nèi)NK殺傷活力[11].於敏等[12]研究表明卡介菌多糖核酸能顯著提高斷奶仔豬外周血淋巴細胞分化增殖，推測其可通過直接作用于外周血淋巴細胞從而增強個體免疫力.本研究結(jié)果表明低濃度卡介菌多糖核酸可顯著促進體外培養(yǎng)的CIK細胞增殖分化，而在機體免疫應(yīng)答過程中，T淋巴細胞和B淋巴細胞的激活、分化、增殖起著重要的作用，因此，卡介菌多糖核酸或可通過直接作用于人周血淋巴細胞從而增強機體免疫力.

卡介菌多糖核酸影響CIK細胞的體外增殖及CIK殺傷肝癌細胞的特點尚無報道.SMMC7721肝癌細胞為本實驗室常用細胞系，材料易得且細胞個體大、生長較快易于實驗，因此在此文中筆者選擇其作為CIK的靶細胞進行殺傷實驗.研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)BCGPSN處理后的CIK細胞相比對照組殺瘤效果有明顯增加，在效靶比為5∶1和10∶1時殺傷率有顯著提高，在靶效比為20∶1時殺傷率也比對照組稍高，表明卡介菌多糖核酸能提高CIK的殺傷能力.

CIK殺傷腫瘤細胞的具體機制還并不清楚，根據(jù)之前相關(guān)的文獻報道，筆者猜測可能與相關(guān)毒活性因子的表達相關(guān)，于是做熒光定量PCR檢測了實驗組和對照組處理后的CIK細胞Granzyme B，TNFα，TNFβ和IFNγ的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這幾類因子的RNA表達水平的確有所提高.Granzyme B，TNFα，TNFβ和IFNγ這幾種因子在CIK細胞殺瘤過程中發(fā)揮著重要作用，本研究也證實了其RNA表達升高促進了CIK殺瘤效果.為了進一步驗證它們在蛋白水平的表達，后續(xù)將購買TNFα和IFNγ的ELISA試劑盒以檢測其在CIK細胞的胞外分泌情況.

顆粒酶B（Granzyme B）是細胞毒性T淋巴細胞（CTL）和自然殺傷（NK）細胞顆粒中絲氨酸蛋白酶家族中發(fā)揮殺傷作用的主要效應(yīng)分子，它能進入靶細胞，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，迅速引起靶細胞DNA的斷裂，使細胞快速凋亡[13].因此，它是殺傷細胞的標志性分子之一.

腫瘤壞死因子 （Tumor Necrosis Factor， TNF ）是一類重要的細胞因子，包括TNFα和TNFβ兩類，TNFα由巨噬細胞和淋巴細胞分泌產(chǎn)生，而TNFβ則由活化的T細胞分泌[14].TNF具有廣泛的生物學活性，對腫瘤細胞有強烈的殺傷作用，還能刺激T細胞、B細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞使其功能增強.本研究結(jié)果顯示，相比生理鹽水對照組，卡介菌多糖核酸能顯著提高TNFα及TNFβ的mRNA表達量.

γ干擾素（Interferonγ，IFNγ）是I型o助T細胞（Th1細胞）的標志性細胞因子，能抑制腫瘤細胞分裂，增強巨噬細胞及 NK 細胞的殺傷性.另外γ干擾素還可增加巨噬細胞對抗原的吞噬，調(diào)動機體免疫系統(tǒng)，提高NK細胞對靶細胞的殺傷以及T淋巴細胞和B淋巴細胞的激活，增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答能力[15].

CIK是目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤過繼免疫治療細胞，因其治療效果與細胞輸注劑量、效應(yīng)細胞比例和對腫瘤細胞毒性有著密切關(guān)系，因此提高其體外的增殖效率和毒性是首要解決的問題.本研究證實低濃度下的卡介菌多糖核酸能促進CIK細胞增殖，又能提高CIK的殺瘤效果，說明卡介菌多糖核酸可以作為一種較好的腫瘤輔助治療藥物.另外CIK細胞殺瘤效率提高的同時相關(guān)毒活性因子的表達也增加，揭示其可能是殺傷腫瘤細胞的途徑之一，這也為進一步研究CIK殺傷腫瘤細胞機制奠定基礎(chǔ)，為抗腫瘤過繼免疫治療提供一些新思路.

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