基因重組精選(九篇)

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第1篇：基因重組范文

9月24日晚間，一則來自平安銀行的公告引爆資本市場。這則公告稱，董事會于9月21日收到董事長肖遂寧、行長理查德·杰克遜的辭呈，兩人的職位擬分別由平安集團副董事長孫建一及剛剛離職的民生銀行副行長邵平接任。

一夜之間將相齊換，平安集團二號人物孫建一進駐銀行順理成章，而“空降”的新任行長邵平則是民生銀行的“宿將”。令人意外的是，直至平安公告之后，民生銀行才發(fā)出公告，確認邵平已從該行副行長任上離職，在此之前無論是民生方面還是平安方面都沒有透出風聲。本刊記者第一時間聯(lián)系肖遂寧和理查德·杰克遜，但兩人都對去職一事三緘其口。

該來的一天還是來了。

只不過，很多深發(fā)展老員工和資本市場都沒有預料到，如此重要的兩項人動會在同一時間。這樣的組合，對于剛剛穩(wěn)定的平安銀行如何引入“平安”基因和“民生”兇悍作風，帶來種種遐想。

平安嫡系

對于肖遂寧及理查德的去職，市場早有預期。平安銀行整合深發(fā)展進程數(shù)年以來，深發(fā)展原副職至最近已經(jīng)換血完畢，原平安銀行相關(guān)高管陸續(xù)入掌深發(fā)展相關(guān)業(yè)務部門，行長及董事長一職的撤換也在情理之中。至此，在現(xiàn)任平安銀行的高管中，只有主管公司業(yè)務的副行長胡躍飛是深發(fā)展的“老人”。

不過，新平安銀行董事長和行長兩大核心職位同時撤換，還是展現(xiàn)出平安一貫強勢的行事風格，同時也標志著平安全面主導時代正式到來。

此次變動中，孫建一出任平安銀行董事長一職并不意外。自從80年代被馬明哲從人保挖到平安之后，孫建一一直是馬的左膀右臂，過去平安通過幾步戰(zhàn)略逐漸組建起合并前的平安銀行的過程，孫建一也長期扮演一線的操盤者，也曾擔任過合并前的平安銀行的董事長。

孫建一在平安集團內(nèi)部一直是“忠厚老者”的形象，為人柔和，處事平衡，擅于拿捏關(guān)系。在平安集團當年的多次關(guān)鍵性談判中，均是由他帶隊出席，并取得了不錯的效果。

在此之前，由于馬明哲負責替集團制定目標和戰(zhàn)略，作為平安集團副董事長的孫則較多地把時間花在對外和具體業(yè)務的溝通協(xié)調(diào)上，在內(nèi)在外都是平安集團的二把手。

在平安銀行整合深發(fā)展的過渡階段，孫建一在兩者的企業(yè)文化融合上所下功夫頗多。2011年，他就和深發(fā)展黨委書記王驥以黨建工作為名，一起跑遍了深發(fā)展的各個省級分行，意即安撫各位地方大員及“推銷”平安文化，減少進一步整合可能引起的文化摩擦。

在他的努力下，平安深發(fā)展換標一事最終朝著預想的方向前進，并于今年8月順利走完了流程。

以孫建一作為新平安銀行的董事長，不但是平安加強對銀行掌控的常規(guī)步驟，也顯示平安集團對這塊目前受托資產(chǎn)管理規(guī)模萬億以上的領域異?？粗?。

作為平安金控架構(gòu)最后完成整合的板塊，平安的一些其它部門諸如信托和產(chǎn)險，都期待與平安銀行的深度合作，而孫建一正是充分釋放板塊協(xié)同效應、提升平安銀行盈利能力的合適人選，其在集團內(nèi)長期積累的權(quán)威和擅于協(xié)調(diào)的個性也有助于銀行在平安的金融綜合協(xié)作大版圖中話語權(quán)的提升。

民生血統(tǒng)

與孫建一的順理成章相比，邵平的“空降”有些讓人驚訝。根據(jù)民生銀行8月底剛剛公布的半年報，作為民生排名第二的副行長，邵平的任期原本至2015年。他亦擔任總行風險管理委員會主席一職，主要負責銀行的風控工作。

從履歷上看，邵平可謂民生銀行名副其實的創(chuàng)業(yè)元老，1995年即參與民生銀行籌建，歷任信貸部總經(jīng)理、上海分行行長、總行行長助理，直至總行副行長，并親身參與了股份制商業(yè)銀行的創(chuàng)建、改革、轉(zhuǎn)型、發(fā)展、壯大的全過程，資歷深厚。

根據(jù)一位民生員工的講述，可能與主管的是風險管理相關(guān)業(yè)務，邵平平日里為人比較低調(diào)，講話較少，“但還是比較有威信的。”

據(jù)知情人士透露，此前浦發(fā)銀行總行曾經(jīng)開展過一輪行長競聘，邵平就是行長候選人之一，但是因為種種原因未能成行，不過此番進駐平安擔任行長，也可以說是“失之東隅，收之桑榆”。

事實上，現(xiàn)在回頭看來，民生銀行對于高管層的變動似乎有所準備，管理層原有四位副行長，除邵平以外，還有邢本秀、趙品璋和毛曉峰，但是幾個月前民生中高層已經(jīng)進行了一輪人事調(diào)整，聘任授信評審部總經(jīng)理石杰、金融市場部總裁李彬和公司銀行部總經(jīng)理林云山擔任行長助理，對未來管理層的新老更替做好準備。

一位股份制銀行人士稱，銀行業(yè)金融機構(gòu)中，平安和民生在風格上有相近的地方，比如都比較崇尚“狼性”文化，也不是特別按照常理出牌。而兩位當家人馬明哲和董文標的個人特點非常鮮明，并極大地投射到企業(yè)特色中，“這對邵平入主平安銀行有一定的幫助作用，在對平安企業(yè)文化的理解和磨合方面，也許會比旁人更加得心應手?！?/p>

不過，長期掌管風控的邵平能否適應平安銀行加速發(fā)展的戰(zhàn)略需求，同樣有待于時間和市場的檢驗。

第2篇：基因重組范文

生長激素的作用

生長激素是由大腦垂體分泌的，rhGH與人自身合成的生長激素相同，其主要功能一是刺激軟骨細胞的增殖和分化，促進骨骼的生長，從而加快身高增長速度；二是通過它以及它作用于肝細胞合成的胰島素樣生長因子，調(diào)節(jié)人體代謝，促進蛋白質(zhì)的合成以及脂肪的分解。

哪些矮小者可以用rhGH

rhGH是治療各種原因引起的生長激素缺乏癥(GHD)的首選藥物，包括特發(fā)性GHD或繼發(fā)于顱腦腫瘤、炎癥、外傷、發(fā)育不良等病變以及放射治療的GHD。對這一類矮小患者，rhGH的療效非常顯著，如一般第一年的連續(xù)治療可使患者長高約10厘米，經(jīng)連續(xù)治療數(shù)年，可明顯改善患者的成年身高（終身高）。rhGH對于因特納綜合征（一種性染色體疾?。?、慢性腎功能不全所導致的矮小，也具有肯定的療效。另外，rhGH對宮內(nèi)發(fā)育遲緩所致的矮小，對遺傳性、家族性或其他病因不明的特發(fā)性矮小，在治療期間具有明確的加快生長的功效，但關(guān)于增加成年身高的作用，雖已有肯定的報道，至今國際上仍然沒有定論。

什么時間開始治療好

總的原則是確診后越早越好。從療效來講，骨齡越小，骨骼生長的潛能越大，因而身高追趕的空間也大。從費用考慮，由于rhGH的治療劑量是根據(jù)體重來計算的，同樣增高1厘米，體重輕者所花的錢自然就少。必須指出的是，慢性腎功能不全的矮小患者的治療只能在腎移植之前進行，而腫瘤患者必須在原發(fā)疾病得到控制的前提下，才可以開始治療。

療程要多長

生長激素的促長作用只表現(xiàn)在用藥期間，換一句話說，你用藥時就長得快，不用藥時，又回到原來的速度（剛停用后的短時間內(nèi)生長還可能較治療前快）。因此，影響療程長短的因素有多個。首先，從醫(yī)療的角度，一般療程越長療效越好，以GHD為例，連續(xù)治療3年以上，才能取得比較滿意的結(jié)果。其次，迄今為止，rhGH的治療費用還是十分昂貴的，對藥費的承受力也決定了療程的長短。再次，患者對治療的依從性、患者自身及其家人對最終身高的期望值、患者開始治療的年齡等都與療程有關(guān)。但是，當患者治療期間的生長速度低于每年2.5厘米，或骨骺已閉合則應停止使用。

治療中需注意的問題

一是診斷。因為生長激素并不能治療所有的矮小癥，所以明確的診斷對于制定治療方案、調(diào)整治療劑量、預測療效、權(quán)衡治療結(jié)果與治療費用都是很重要的。如垂體功能減退患者除生長激素外，還需補充其他的垂體激素。又如，治療不同原因引起的矮小時，使用的劑量是不同的，因特納綜合征患者所需的劑量較GHD大。

第3篇：基因重組范文

00：41

相比前代車系，全新思域的外觀設計顯得更加大膽、年輕化，激進的前臉配以流暢的車身線條，極大地提升了整車運動感。值得注意的是，新一代車型較上一代車型增寬了約50mm、車身高度降低了25mm，軸距則拉長約30mm。在突顯運動性的同時，進一步擴充了后排空間。車體重量經(jīng)過輕量化改進后減重30.76kg。

01：45

內(nèi)飾方面，全新思域更加體現(xiàn)了以駕駛員為中心的座艙設計理念，方向盤、儀表盤造型不僅更加動感，車內(nèi)質(zhì)感也得到了提升。另外，多媒體配置水平與雅閣保持一致，這其中就包括了中控臺上的7英寸觸控屏幕，其可以在智能手機的對應功能上全面支持Apple CarPlay與Android Auto系統(tǒng)。

02：25

全新思域的安全性也得到進一步加強。本田Sensing主被動安全科技被引入，包括降低碰撞損傷的CMB預警式煞車系統(tǒng)、RDM車道偏移警示以及支持可低速跟車行駛的新一代ACC主動式巡航系統(tǒng)等，均保證了駕馭安全性。乘坐空間方面，新一代思域后排腿部空間增加了約51mm，同時行李廂容積也得到了提升。

03：28

全新思域擁有最大功率116kw的2.0L自然吸氣發(fā)動機與最大功率127kw的1.5T直噴渦輪增壓發(fā)動機可選。前者可匹配6速手動或CVT變速器，后者則匹配的是一款專門針對渦輪增壓發(fā)動機研發(fā)的CVT無級變速器。

03：47

這款2.0L自吸發(fā)動機并非之前1.8L發(fā)動機的后裔，而是跟本田那臺在前幾年一舉創(chuàng)下量產(chǎn)汽油發(fā)動機的最高熱效率記錄的LFA型發(fā)動機沾親帶故。在國內(nèi)渦輪發(fā)動機愈發(fā)火熱，并且2.0L和1.5T最大功率相近的情況下，預計2.0L發(fā)動機并不會在未來的國產(chǎn)版車型上出現(xiàn)，而1.5T地球夢直噴渦輪增壓發(fā)動機將會引入國內(nèi)。

第4篇：基因重組范文

（貴州師范大學蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心／生命科學學院植物遺傳育種研究所，貴陽 550001）

摘要：以貴州師范大學蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心建立的兩個甜蕎（Fagopyrum esculentum）重組自交系群體（Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1）的親本為研究對象，選取了5個多態(tài)性好、帶型清楚的隨機引物進行RAPD分析，計算了每對親本之間的相似度系數(shù)，并構(gòu)建了各親本的RAPD指紋圖譜。結(jié)果表明，在Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1的親本中，平均相似度系數(shù)分別為39．13％和42．69％；在構(gòu)建的RAPD指紋圖譜中，有29條譜帶為Homo（P1）所獨有，27條譜帶為甜自100（P2）所特有；有26條譜帶為Lorena－3（P1）所獨有，25條譜帶為甜自21－1（P2）所特有。蕎麥特異譜帶可以作為品種鑒定的分子標記。

關(guān)鍵詞 ：甜蕎（Fagopyrum esculentum）；RAPD；多樣性；DNA指紋圖譜

中圖分類號：S517 文獻標識碼：A 文章編號：0439－8114（2015）02－0284-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.008

甜蕎（Fagopyrum esculentum）為蕎麥大粒組類群7個生物學物種之一［1］。Chen［2，3］的試驗研究表明，普通蕎麥中存在著大量的形態(tài)變異，而對這些變異進行深入研究將在很大程度上有利于遺傳育種。基因控制著生物體的性狀表達和變異，研究DNA分子的多態(tài)性也會促進對形態(tài)變異的進一步探索，并在遺傳育種中為選擇強優(yōu)勢組合的親本進行雜交和蕎麥資源的鑒定提供科學依據(jù)［4］。

RAPD技術(shù)是以PCR為基礎的一項檢測物種DNA多態(tài)性的分子技術(shù)［5］。該技術(shù)的優(yōu)點是DNA樣品需求量??；無種屬和基因組結(jié)構(gòu)特異性，一套引物可用于不同生物基因組分析；試驗成本低；試驗技術(shù)簡單，檢測速度較快。RAPD在蕎麥中應用主要集中在蕎麥的遺傳多樣性和種間系統(tǒng)關(guān)系研究方面［6］。通過建立RAPD指紋圖譜，尋找每個種類的恒定譜帶和獨特譜帶，可以迅速準確地對蕎麥種類進行鑒別。近年來，RAPD技術(shù)已應用于多種植物雜交組合后代鑒定［7，8］和種子純度的檢測等。Ohinshi等［9］、Tsuji等［10］利用AFLP和RAPD技術(shù)研究苦蕎栽培品系和天然種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Sharma［11］應用RAPD技術(shù)研究了蕎麥屬14個種之間的遺傳多樣性。Kump等［12，13］采用RAPD技術(shù)進行了苦蕎33個栽培種之間遺傳關(guān)系的分析。許瑾等［4］利用RAPD技術(shù)對蕎麥屬的9個品種進行基因組指紋圖譜分析。譚萍等［14］采用RAPD方法對國內(nèi)10個蕎麥栽培種進行基因型分析，并建立了指紋圖譜。Pan等［15］以F． esculentum Moench， F． esculentum var． homotropicum 及其雜交所建立的 225 株 F2代分離群體為材料，進行了 RAPD 與 STS 標記分析和重要形態(tài)性狀遺傳分析，并由此構(gòu)建遺傳標記連鎖圖譜，共涉及87個RAPD標記，12個STS標記。覆蓋基因組長度655．2 cM?？偟恼f來，由于普通蕎麥自交不親和，相關(guān)研究主要以蕎麥品種或品系為材料，主要運用RAPD等標記。

在重組自交系中，利用親本DNA樣品進行RAPD 標記引物篩選，并將重復性好的引物進行其可育F2代分離群體樣本的PCR擴增，用以分析甜蕎RAPD標記多態(tài)性和構(gòu)建起分子遺傳連鎖圖譜。本研究對普通蕎麥重組自交系群體親本組合（Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1）的親本用5種隨機引物的RAPD譜帶進行多態(tài)性分析和指紋圖譜建立，以期為其F2代自交系群體的進一步研究打下基礎。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

本研究選用了甜蕎重組自交系的4個親本甜蕎種，分別為Lorena－3、甜自21－1、甜自100和Homo。重組自交系的親本組合為：Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1。甜蕎品種由貴州師范大學蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供。

1．2 DNA提取

取2～3周苗齡的新鮮健康葉片約300 mg置于研缽中，倒入液氮，研成粉末。將該粉末直接轉(zhuǎn)入裝有預熱的含有15 μL β－巰基乙醇的1 000 μL 2％ CTAB提取緩沖液（質(zhì)量濃度2％ CTAB，100 mmol／L pH 8．0 Tris－HCl，50 mmol／L EDTA－Na2，1．4 mol／L NaCl，質(zhì)量濃度2％ PVP）的5 mL離心管中，輕輕搖動使其充分混勻，置于65 ℃水浴中保溫60 min（每隔20 min輕輕顛倒混勻1次），加入酚／氯仿／異戊醇混合液（25∶24∶1，V／V／V），充分混勻，常溫下靜置10 min，10 000 r／min 離心10 min。將上清液加入氯仿／異戊醇混合液（24∶1，V／V），輕輕混勻，室溫下10 000 r／min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入2倍體積－20 ℃冰凍的無水乙醇，輕輕顛倒離心管直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，將離心管放在 －20 ℃中沉淀10 min。離心沉淀DNA并將沉淀用 －20 ℃冰凍的體積分數(shù)為70％的乙醇洗滌兩次，在室溫下使DNA沉淀干燥。加入600 μL TE緩沖液，完全溶解后，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 引物

共使用了5個隨機引物，各引物序列見表1。該引物從貴州師范大學蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心設計的25個引物中選取，以親本間多態(tài)性好、電泳帶型清晰、重復性好為主要篩選原則。

1．4 PCR反應體系

試驗中，RAPD檢測使用的PCR反應體系見表2。PCR反應程序為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，Tm（引物不同溫度不同）退火1 min，72 ℃延伸2 min，38個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1．5 統(tǒng)計分析方法

擴增產(chǎn)物于0．8％的瓊脂糖凝膠中電泳，在BioSenSC805型全自動凝膠成像系統(tǒng)的Analysis工具欄中，點擊消除背景圖標以消除圖像本底的干擾；點擊自動檢測所有泳道的條帶圖標以進行各泳道內(nèi)條帶檢測；點擊相對分子質(zhì)量計算圖標，以Marker泳道內(nèi)的Marker條帶的相對分子質(zhì)量為標準設定相對分子量曲線圖，關(guān)閉Marker窗口，則會顯示各個條帶的相對分子質(zhì)量，統(tǒng)計各泳道內(nèi)的條帶數(shù)。

參考文獻［16］，采用條帶相似度系數(shù)分析條帶的多樣性。相似度系數(shù)SD＝（2nAB）／（nA＋nB），nA為A泳道內(nèi)的DNA條帶數(shù)，nB為B泳道內(nèi)的DNA條帶數(shù)，nAB是A、B泳道內(nèi)共有的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 親本甜蕎的RAPD電泳圖譜

不同引物擴增的親本甜蕎的RAPD電泳圖譜如圖1和圖2所示。

2．2 親本甜蕎RAPD標記的多樣性分析

根據(jù)篩選出的5個隨機引物的RAPD擴增結(jié)果，可以對每對雜交組合中的兩個親本進行擴增條帶的多樣性分析，兩對雜交組合親本中各引物的擴增情況與相似度系數(shù)見表3和表4。

由表3可知，對親本Homo（P1）×甜自100（P2）的組合進行RAPD擴增，5個引物共擴增出92條譜帶，平均每個隨機引物產(chǎn)生了18．4條譜帶。這些引物的擴增產(chǎn)物為17～20條譜帶，其中擴增條帶數(shù)目最多的是引物R1182，共有20條譜帶；其次為引物R52和R428，均為19條譜帶；最少的為引物R41和R353，擴增出17條譜帶。

對親本Homo（P1）×甜自100（P2）組合的所有隨機引物的RAPD標記多樣性進行檢測，結(jié)果（表3）表明，在5個隨機引物獲得的92條譜帶中，有18條譜帶在兩親本間表現(xiàn)為相同譜帶，RAPD標記的相似度系數(shù)為39．13％（36／92）。對于每一條引物的相似度系數(shù)來說，其變化范圍為31．58％（6／19）～50．00％（10／20）。其中RAPD標記的相似度系數(shù)最高的引物是R1182，達到了50．00％，引物R428的標記相似度系數(shù)最低，為31．58％（6／19）。因此，本研究所采用的雜交組合親本Homo（P1）×甜自100（P2）在基因組DNA水平上存在較低的RAPD標記相似度系數(shù)，即DNA水平上條帶的多樣性較為豐富。有利于其子代群體獲得更為廣泛的性狀變異。

由表4可知，對親本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的組合進行RAPD擴增，5個引物共擴增出89條譜帶，平均每個隨機引物產(chǎn)生了17．8條譜帶。這些引物的擴增產(chǎn)物為15～20條譜帶，其中擴增條帶數(shù)目最多的是引物R1182，共有20條譜帶；而后依次為R52、R353、R41、R428，擴增出的譜帶數(shù)分別為19、18、17、15。

對Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的親本組合所有隨機引物的RAPD標記多樣性進行檢測，結(jié)果（表4）表明，在5個隨機引物獲得的89條譜帶中，有51條譜帶在兩親本間的表現(xiàn)存在差異性，RAPD標記的相似度系數(shù)為42．69％（38／89）。對每條引物的標記相似度系數(shù)來說，其變化范圍為40．0％（6／15）～47．06％（8／17）。其中RAPD標記的相似度系數(shù)最低的引物為R428和R1182，相似度系數(shù)為40．00％，R41的標記相似度系數(shù)最高，達47．06％（8／17）。因此，本研究所采用的雜交組合親本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）基因組DNA水平上同樣存在較低的RAPD標記相似度，也存在較高的多樣性，將有利于其子代群體獲得更為廣泛的性狀變異。

2．3 親本甜蕎的RAPD指紋圖譜

根據(jù)全部隨機引物擴增產(chǎn)物的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果，將能在親本組合中穩(wěn)定擴增出現(xiàn)的、且具有差異的特異性譜帶用來構(gòu)建親本組內(nèi)P1和P2的RAPD標記指紋圖譜。在Homo（P1）×甜自100（P2）的親本中，共擴增出56條差異性譜帶（表5）；在Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的親本中，共擴增出51條差異性譜帶（表6）。

由表5和表6可知，Homo（P1）×甜自100（P2）和Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）組合親本RAPD指紋圖譜存在較明顯的差異性。前者中有28條譜帶為Homo（P1）所獨有，27條譜帶為甜自100（P2）所特有；后者中有24條譜帶為Lorena－3（P1）所獨有，24條譜帶為甜自21－1（P2）所特有。因此，在每對雜交組合中，存在差異的譜帶可看作是兩親本的特征性譜帶，而由RAPD指紋圖譜所反應的這些特征譜帶可以作為鑒別親本的依據(jù)，也可為進一步對雜交組合中親本的DNA多態(tài)性及其他分子遺傳研究打下基礎。

3 討論

Deng等［17］利用7個隨機引物對19個蕎麥（包括甜蕎和苦蕎）品種進行RAPD分析，結(jié)果表明其平均多態(tài)性達94．89％，而本研究結(jié)果表明，甜蕎重組自交系的兩對親本組合的平均相似度系數(shù)分別為39．13％（Homo×甜自100）和42．69％（Lorena－3×甜自21－1），再次在DNA水平上說明蕎麥種間的多態(tài)性遠高于種內(nèi)多態(tài)性。同時，對同屬甜蕎品種的兩個親本組合而言，其低于50％的相似度系數(shù)也從DNA的角度解釋了甜蕎異花授粉、自交不親和等生殖學特征所帶來的物種基因重組的多態(tài)性現(xiàn)象。在對蕎麥進行種類劃分的研究中，部分種類難以從形態(tài)學上進行識別，分類特征也常存在較大變異，難以把握。本研究在DNA水平上進行的RAPD遺傳標記分析可對蕎麥品種鑒別和遺傳歧化研究提供依據(jù)。

此外，本研究以重組自交系親本為研究對象進行RAPD分析，發(fā)現(xiàn)自交系群體親本之間存在較多的特異RAPD譜帶，也可為以重組自交系為研究對象進行的相關(guān)農(nóng)藝學特征遺傳及分子標記研究奠定基礎。

參考文獻：

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第5篇：基因重組范文

【摘要】 目的 構(gòu)建細粒棘球蚴鐵蛋白基因的重組表達質(zhì)粒ferritin/pET-28a，表達、純化出重組蛋白，并對重組蛋白的免疫學特性進行初步研究。方法 將目的基因亞克隆至表達載體pET-28a，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)plysS，加入IPTG對其進行誘導表達。通過Ni2+的His-bind樹脂柱純化出重組蛋白，用50μg/100μL免疫ICR小鼠，獲得抗血清，通過western-blot及ELISA對重組鐵蛋白的免疫學特性進行初步研究。結(jié)果 表達并純化出分子量約19kD重組鐵蛋白，western-blot顯示重組蛋白免疫制備的抗血清可識別純化的重組蛋白及抗原囊液、原頭蚴，位置大致相同，約19kD。ELISA結(jié)果顯示實驗組小鼠與對照組小鼠血清中IgG的OD值有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)論 細粒棘球蚴重組鐵蛋白Eg.ferritin具有較好的抗原性及免疫原性，具有成為包蟲疫苗候選分子的潛能。

【關(guān)鍵詞】 細粒棘球蚴；重組鐵蛋白；純化；免疫特性

鐵蛋白(ferritin)是普遍存在于生物體內(nèi)的一種保守性較高的多功能多亞基蛋白，其作用是儲存鐵，對生物體內(nèi)鐵含量進行調(diào)控，在生物體內(nèi)鐵含量過多時起到解毒作用［1-2］，它的存在保證了生命體的正常活動。本實驗中心已構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒ferritin/pGEX-6p-1，但由于重組蛋白ferritin/GST以包涵體形式存在于細胞中，無法通過親和層析柱純化出單一的Eg.ferritin［3］。只能通過切膠純化的方法獲得融合蛋白Ferritin/GST，雖然試驗結(jié)果說明該融合蛋白具有較好的抗原性及免疫原性，但影響蛋白特性的因素較多，不能很好的反映蛋白的實際特性，因此本次試驗將鐵蛋白基因重組到表達質(zhì)粒pET-28a中，pET-28a是個高效表達載體，能純化變性及非變性的蛋白，通過表達純化可獲得較純的Eg.ferritin，以便更好地研究蛋白的特性，為鐵蛋白能成為包蟲病候選疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌種 Eg.ferritin/pGEM-T/JM109及E.coli BL21(DE3)plysS由本室保存；pET-28a表達載體購自Novagen公司。

1.2 試劑 T4連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、Not I、IPTG、N'N'N'N-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自Promega公司；β-巰基乙醇、二甲基亞砜、弗氏完全(不完全)佐劑、過硫酸銨、Tween-20等試劑購自于SIGMA公司；考馬斯亮藍購自BIOMOL公司；酵母提取物、蛋白提取物購自OXOID公司；蛋白預染Marker購自北京賽百盛；卡那霉素、TMB、4-氯-1-奈酚購自AMRESCO；羊抗鼠HRP-IgG、質(zhì)粒DNA提取試劑盒等購自北京華美公司；DNA純化回收試劑盒購自北京賽百盛生物有限公司；標準蛋白分子量Marker 購自中國科學院上海生物化學研究所；含Ni2+的His-bind樹脂純化試劑盒購自Novagen公司；其它常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗動物 ICR小鼠，6～8周，(18±2)g，雌性，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.4 Eg.ferritin/pET-28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 取Eg.ferritin/pGEM-T/JM109菌株劃板接菌［4］，并挑單個菌落進行培養(yǎng)，通過堿裂解法提取重組質(zhì)粒；同時取適量的表達載體pET-28a，將兩者分別用BamH I，Not I進行雙酶切處理，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離帶有雙黏性末端的目的片段和表達載體，切膠，經(jīng)DNA回收試劑盒純化目的片段及載體。目的片段與表達載體在T4連接酶的作用下，16℃連接過夜。繼而將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到已制備好的感受態(tài)菌BL21(DE3)plysS中［5］，經(jīng)含卡那霉素終濃度為50μg/mL的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性菌株［6］。挑取陽性菌株含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒純化重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I，Not I進行酶切鑒定。

1.5 重組鐵蛋白的表達、純化

1.5.1 重組蛋白的表達 將重組菌接種于含卡那霉素(終濃度為50μg/mL)的3mL 的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)數(shù)小時，按1∶50接種于50mL培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)至OD600=0.5時，加入IPTG至終濃度為0.05mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h，4℃ 4000r/min 離心15min，棄上清，收集細菌沉淀，SDS-PAGE觀察表達情況。

1.5.2 表達產(chǎn)物的鑒定 將樣本與2×SDS-PAGE樣本緩沖液混合，經(jīng)12% SDS-PAGE，180V電壓，電泳至溴酚蘭指示劑到膠底為止，用0.2%考馬斯亮藍R250染色2h，用含7%冰醋酸5%甲醇的脫色液脫色至本底無色。

1.5.3 重組抗原的純化及制備 對細胞進行裂解，發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式存在，按照Novagen公司His-bind樹脂純化試劑盒說明書中的包涵體大量純化方法進行純化，然后將純化好的包涵體蛋白放入透析袋中，用1×PBS透析去除尿素。

1.6 動物免疫及特異性抗血清的制備

1.6.1 動物免疫 ICR小鼠分兩組，即免疫組與對照組，每組10只。1)免疫組每只注射弗氏佐劑與重組抗原Eg.ferritin的乳化劑50μg/100μL。對照組注射弗氏佐劑和PBS的乳化劑100μL。根據(jù)Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝膠分析系統(tǒng)對純化的抗原進行定量。2)免疫方法 每組小鼠在0、2、4周各免疫1次，共3次，第1次基礎免疫用弗氏完全佐劑，以后2次為加強免疫均用弗氏不完全佐劑。采用背部皮下多點注射免疫，每次注射量為100μL/只。分別于0、2、4、6周斷尾采血，共4次，8周眼眶取血并處死小鼠。

1.6.2 特異性抗血清的制備 將血液4000r/min 離心 10min，提取血清，-20℃保存。

1.7 血清特異性識別 純化的重組抗原Eg.ferritin、天然可溶性抗原囊液、原頭蚴通過10%分離膠及5%的濃縮膠，180V電壓下進行SDS-PAGE電泳 1h。在30mA下對硝酸纖維膜進行印跡轉(zhuǎn)移1h。然后將硝酸纖維膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中，37℃ 封閉1h，以PBS-T(PBS中含0.5‰ Tween-20)溶液洗3次，每次5min。再將硝酸纖維膜剪開分別浸泡于1∶100稀釋的Eg.ferritin免疫的特異性小鼠抗血清及對照組鼠血清中，4℃ 過夜。次日將膜用PBS-T溶液洗3次，每次5min，然后與1∶1000稀釋的羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合，37℃反應1h。再以PBS-T溶液洗4次，每次10min。加入新配制的底物液(6mg 4-氯-1-奈酚，2mL冷甲醇，10mL的TBS，12μL的H2O2)37℃顯色5min，最后用蒸餾水沖洗終止反應。

1.8 抗血清中IgG的測定 采用ELISA法，用純化的Eg.ferritin 5μg/mL包被酶標板100μL/孔，4℃過夜。次日，PBS-T洗3次，5％牛奶封閉100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗3次，取0～8周的免疫組及對照組小鼠血清作為一抗，按1∶100稀釋，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，羊抗鼠HRP-IgG為二抗，按1∶1000稀釋，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，加入顯色劑100μL/孔，待對照孔顯色時，加入2M H2SO4 50μL/孔 終止反應。以包被抗原及進行牛奶封閉的孔為空白調(diào)零，置酶標儀450nm波長處測OD值。

1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.0統(tǒng)計學分析軟件，采用兩樣本t檢驗的方法對測定的OD值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 表達質(zhì)粒Eg.ferritin/pET-28a的酶切鑒定

將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒Eg.ferritin/pET-28a 用限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I 雙酶切后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測到插入片斷大小約560bp，與目的基因片段相符。M1.Lambda DNA/HindⅢMarker；1.pET-28a空質(zhì)粒；2.Eg·ferritin/

2.2 Eg.ferritin 的純化

含Ni2+的His-bind樹脂親合柱純化Eg.ferritin/pET-28a表達的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE，根據(jù)標準蛋白分子量可知，純化蛋白的分子量約19kD.

2.3 特異性抗血清識別純化蛋白和天然抗原

純化Eg.ferritin免疫小鼠制備的抗血清可特異性識別未純化的重組Eg.ferritin，純化的Eg.ferritin 及天然抗原(原頭蚴、囊液)，識別蛋白條帶的位置大致相同約19kD(見圖3)。

2.4 小鼠血清IgG水平變化

根據(jù)對小鼠血清IgG水平在0～8周變化趨勢的檢測及對免疫組和對照組小鼠血清IgG的比較發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中IgG的水平隨著免疫次數(shù)及時間的延長呈上升趨勢，免疫4周以后同一時期的免疫組小鼠血清中的IgG水平明顯高于對照組(P＜0.01)。表1 兩組小鼠免疫不同時間血清IgG水平變化

3 討論

本實驗將細粒棘球蚴鐵蛋白基因重新克隆到表達載體pET-28a上，主要考慮：① pET-28a表達載體具有高效表達的能力［7］；② pET28a質(zhì)粒在插入目的DNA后表達的蛋白N 末端含6個組氨酸，它作為His標簽蛋白，可與Ni2+鰲合，使得重組融合蛋白在變性或非變性狀態(tài)下均可被含Ni2+的His-band 樹脂親合柱純化，即使被純化的重組蛋白含量很低也能被有效地純化出來?？朔吮局行囊呀?jīng)構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒ferritin/pGEX-6p-1表達的重組蛋白ferritin/GST不能通過GSTTrapTMFF親和層析柱純化的弊端［3］；③重組蛋白是標簽蛋白His和目的蛋白共同組成的融合蛋白，為獲取目的蛋白，本應通過相應的剪切酶將標簽蛋白剪切下來，但由于N-末端組氨酸所表達的蛋白分子量很小，它的存在不改變目的蛋白的活性，所以無須去除。這不僅能減少實驗步驟，降低純化蛋白在酶切過程中的損失，同時還可節(jié)省用來購買剪刀酶的費用，為后續(xù)研究提供了較好的實驗材料。基于此我們得到了一個高效表達且易于純化重組蛋白的基因工程菌株，并得到了較純的重組蛋白，進行動物實驗。通過實驗說明Eg.ferritin作為抗原可誘導動物產(chǎn)生較強的的體液免疫應答，證明其有良好的抗原性；免疫血清與細粒棘球蚴天然抗原(囊液和原頭蚴)的Western blot實驗結(jié)果顯示，免疫血清能夠較好地識別天然抗原中位于19kD處的條帶，說明Eg.ferritin具有較好免疫原性，由此推測中國大陸株細粒棘球蚴鐵蛋白基因具有作為包蟲疫苗候選分子的潛能，為進行重組鐵蛋白對宿主的免疫保護性及保護性機制等方面研究的可能性提供了依據(jù)。

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第6篇：基因重組范文

【摘要】 目的 應用細菌內(nèi)同源重組高效制備p53基因重組腺病毒。方法 設計引物擴增p53基因，在上下游引物分別引入Xhol和HindⅢ酶切位點，將p53基因亞克隆連接到經(jīng)相同酶切的p shuttle-cmv轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化DH5α篩選卡那霉素抗性菌落構(gòu)建重組腺病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p shuttle-cmv-p53用Pmel酶切線性化采用兩步法進行同源重組：先將腺病毒骨架質(zhì)料pAdEasy-1轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的BJ5183感受態(tài)細菌，篩選得到鏈霉素和氨芐青霉素抗性的AdBJ5183轉(zhuǎn)化菌；再將線性化的p shuttle-cmv-p53轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的AdBJ5183感受態(tài)細菌，在細菌內(nèi)進行同源重組，挑選卡那霉素抗性菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，瓊脂糖電泳挑選大片斷的重組質(zhì)粒pAdBJ5183-P53分別用限制性內(nèi)切酶PacI和BstXI及PCR法鑒定。結(jié)果 成功構(gòu)建了p53基因重組腺病毒表達載體。結(jié)論 采用簡化的兩步氯化鈣化學轉(zhuǎn)化法可以取代電穿孔法高效構(gòu)建重組腺病毒表達載體。

【關(guān)鍵詞】 腺病毒載體；同源重組；p53基因

【Abstract】 Objective To construct recombinant replication-defective human adenovirus serotype 5 vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination protocol in bacteria.Methods wt-p53 gene was firstly subcloned into a transfer vector p shuttle-cmv and the positive recombinant p shuttle-p53 was linearized by PmeI.Then the simplified two-step homologous recombination protocol was employed for the construction of recombinant adenoviral vector.In step one，adenoviral skeletal plasmid pAdeasy-1 was transformed into BJ5183 competent cells by calcium chloride chemical methed to obtain pAdBJ5183;and in step two，linearized psh-p53 plasmid was transformed into pAdBJ5183.The possible positive adenoviral plasmids were selected by agarose gel electrophoresis and indentified by PacI as well as BxtXI cleaved pattern.Results Replication-defective recombinatant adenovirus containing human p53 gene was successfully constructed.Conclusion The results indicated that the calcium chloride chemically simplified two-step homologous recombination protocol can replace the co-transformation by electroperforation and may have broaed utility in system that involve homologous recombination in bacteria.

復制缺陷型腺病毒可以高效介導基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移；感染細胞范圍廣，不但可以感染分裂期細胞，也可感染靜止期細胞；感染細胞時其DNA不整合到宿主細胞染色體中，安全可靠。因此成為基因治療中常用的載體。重組腺病毒載體的構(gòu)建方法有真核細胞內(nèi)質(zhì)粒重組法、酵母人工染色體克隆系統(tǒng)、Cre/loxp定點重組系統(tǒng)、末端蛋白-DNA復合物共轉(zhuǎn)染法等［1～3］。以上方法牽涉到的步驟和環(huán)節(jié)較多、工作量大、實驗周期長。1998年He等［4］建立了細菌內(nèi)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化同源重組方法，該法簡便快速、實驗周期短，但是共轉(zhuǎn)化需要電穿孔儀，且同源重組成功率不到20%。筆者在實際工作中對該法進行了改進，采用簡化的兩步氯化鈣化學轉(zhuǎn)化法代替電穿孔共轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了p53重組腺病毒表達載體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 pAdEasy-1、pshuttle-cmv質(zhì)粒，BJ5183、

DH5α大腸桿菌，PmeI酶購自Qbiogene公司；攜帶p53基因的質(zhì)粒由馬延高教授惠贈；PacI酶購自New England公司；PCR Premix、DL2000Marker購自TaKaPa公司；λDNA·HindⅢMarker購自Promega公司；其他分子生物學工具酶購自MBI公司。

1.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建 設計擴增p53基因的上下游引物分別為：

p53-up:5 atg tct cga gat gga gga gcc gca gtc aga 3 （30bp），

p53-down:5 aag taa gct ttc agt ctg agt cag gcc ctt 3 （30bp），在上下游引物分別引入XhoI和HindⅢ酶切位點，由上海生工合成。采用上述引物以攜帶p53基因的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增p53基因片斷。PCR參數(shù)為：94℃變性5min;94℃30s、56℃30s、72℃50s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。用XhoI和HindⅢ酶切PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳回收，連接到同樣經(jīng)XhoI和HindⅢ酶切回收的pshuttle-cmv轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中；轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，卡那霉素抗性平板篩選。

1.3 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的鑒定 挑選卡那霉素抗性平板篩選菌落培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，用XhoI和HindⅢ酶切鑒定，并以能酶切出與目的基因片段大小相符的質(zhì)粒為模板，用上述引物進行PCR鑒定。得到的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為psh-p53。再用上述引物由上海生工公司測定psh-p53中目的基因片段序列。

1.4 兩步法細菌內(nèi)同源重組產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒

1.4.1 step1:用氯化鈣法制備BJ5183感受態(tài)細菌 將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細菌，接種在鏈霉素和氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，以pAdEasy-1為對照，用BstXI酶切鑒定，得到的陽性菌命名為AdBJ5183菌。

1.4.2 step2:同源重組 用氯化鈣制備AdBJ5183感受態(tài)細菌；將序列正確的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-p53用PmeI酶切線性化，不需滅活PmeI酶，也不需回收，直接取大約30ng酶切線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AdBJ5183感受態(tài)細菌，卡那霉素抗性平板篩選，挑取菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖電泳初篩分子量大于30kbp的質(zhì)粒，以pAdEasy-1為對照，分別用PacI、BstXI酶切鑒定，對酶切圖譜符合的質(zhì)粒采用前述擴增目的的基因片段的引物進行PCR鑒定。得到的陽性菌命名為AdBJ5183-p53菌。相應的陽性重組腺病毒質(zhì)粒為pAdBJ5183-p53。再將AdBJ5183P53轉(zhuǎn)化DH5α得到pAdp53。

2 結(jié)果

2.1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-P53的構(gòu)建及鑒定

（1）重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-P53經(jīng)XhoI和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，出現(xiàn)一條約7.4kg的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒帶和一條約1.2kb的p53目的基因帶，見圖1。

（2）以能酶切出與目的基因片段大小相符的質(zhì)粒為模板，用擴增目的基因的引物進行PCR鑒定。可以得到約1.2kb大小的片斷，見圖2。

（3）測序結(jié)果經(jīng)Vector NTI軟件分析正確。

2.2 重組腺病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

（1）將腺病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)菌，抽提鏈霉素和氨芐青霉素雙抗性的質(zhì)粒，對照骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，用BstXI酶切鑒定。pAdEasy-1質(zhì)粒有6個BstXI酶切位點，可以產(chǎn)生6個片斷。電泳結(jié)果顯示，AdBJ5183質(zhì)粒與pAdEasy-1圖譜一致，見圖3。

（2）線性化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-p53轉(zhuǎn)化AdBJ5183感受態(tài)細菌進行同源重組后，抽提卡那霉素抗性的質(zhì)粒，0.8%脂糖電泳發(fā)現(xiàn)有2種質(zhì)粒：其一分子量約34kb，為可能的重組腺病毒質(zhì)粒；另一分子量約9kb，為重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-p53。可以很直觀方便地初篩出可能的大片斷重組腺病毒質(zhì)粒（圖略）。

PacI酶切分子量約34kb的質(zhì)粒可出現(xiàn)一條約30～35kb的大片斷和一條4.5kb的特征性片斷見圖4。與預期結(jié)果相符。

BstXI酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒 PAdEasy-1質(zhì)粒有6個BstXI酶切位點，可以產(chǎn)生6個片斷，依次為11921bp、8237bp、5251bp、4254bp、2379bp、1399bp。其與線性化的psh-p53在BJ5183中發(fā)生同源重組的位置只引起片斷2的改變。本實驗采用Pshuttle-cmv為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，同源重組后片斷2將漂移至11～12kb左右，與片斷1重疊，只可以觀察到5條帶。與預期結(jié)果相符。結(jié)果見圖5。

以酶切鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒為模板進行PCR，可擴增出與目的基因大小相符合的片斷，見圖6。

3 討論

傳統(tǒng)的構(gòu)建重組腺病毒的方法是在293細胞內(nèi)進行質(zhì)粒間同源重組，這些方法存在細胞類同源重組效率低、實驗周期長等缺點，給研究工作帶來了諸多不便；利用生長周期快、操作方便的大腸桿菌實現(xiàn)質(zhì)粒間同源重組產(chǎn)生腺病毒的方法具有重組效率高、病毒基因組高度一致、不需蝕斑純

化篩選純系病毒等優(yōu)點。在進行細菌內(nèi)同源重組時，最初的方法是將腺病毒骨架質(zhì)粒和線性化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒電穿孔共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，這種方法需要電穿孔儀，而且重組效率相對較低；Zeng等［5］采用兩步法進行了改進，先用電穿孔法將骨架質(zhì)粒PAdEasy-1轉(zhuǎn)化電穿孔感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，得到BJ5183AdEasy，再將線性化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒電穿孔法轉(zhuǎn)化電穿孔感受態(tài)大腸桿菌BJ5183AdEasy進行同源重組，由于該法是將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已攜帶有骨架質(zhì)粒的繁殖能力強的BJ5183菌中，避免了將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到有缺陷或復制能力弱的細菌中，因而成功率提高到94%（16/17），但該法仍然需要電穿孔儀，一般實驗室難以推廣。筆者將該兩步法的電穿孔部分改為傳統(tǒng)的氯化鈣化學轉(zhuǎn)化法，而且線性化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒不需經(jīng)過熱滅活PmeI酶及凝膠電泳回收，直接用于轉(zhuǎn)化，也得到了較高的重組率（6/8）。本研究正在進行p53基因重組腺病毒生物學特性的研究及對腫瘤細胞作用的研究。

1 顧建人，曹雪濤.基因治療.北京：科學出版社.2001，197.

2 Ng P，Parks RJ，Cummings DT，et al.A high-efficiency Cre/loxP-based system for constrction of adenoviral vectors.Hum Gene Ther，10:2667-2672.

3 Kamen A，Henry 0.Development and optimization of an adenovirus production process.J Gene Med，2004，6:184-192.

第7篇：基因重組范文

關(guān)鍵詞Nef基因；SW480細胞；G418；穩(wěn)定細胞系

艾滋?。ˋIDS）全稱為“獲得性免疫缺陷綜合征”，是一種由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的，以全身免疫系統(tǒng)嚴重損害為特征的傳染性疾病.RNA干擾（RNAi）是細胞內(nèi)序列特異性抑制靶基因表達的機制，具有高效性、特異性和副作用小的特點，將其應用于抗HIV1 治療研究是近來研究熱點[12].RNAi抑制HIV1的復制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干擾HIV1病毒的RNA，據(jù)文獻報道幾乎HIVl的所有基因都可作為干擾的靶點：如LTR[3]〖KG-*6〗，gag[45]〖KG-*6〗，pol[6]〖KG-*6〗，vpu[7]〖KG-*6〗，vif[5]〖KG-*6〗，tat[8]和env[9]等基因.RNAi還可以將干擾的位點靶定到細胞上與HIV病毒感染密切相關(guān)的受體蛋白、輔助受體蛋白或其他的一些細胞因子[10].

負調(diào)控因子（negative factor，Nef） 是人免疫缺陷病毒（ HIV） 附屬蛋白之一，相對分子質(zhì)量小，柔韌性大，核心結(jié)構(gòu)呈球形.Nef 不具酶活性，具有銜接蛋白的作用，可下調(diào) CD4，主要組織相容性復合體Ⅰ（MHCⅠ），主要組織相容性復合體Ⅱ（MHC Ⅱ）和 CD28 分子，在對抗宿主免疫應答過程中發(fā)揮重要作用.Nef 可增強病毒的復制和感染性，抑制 HIV 感染細胞的凋亡，在 HIV 致病機制方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用.基于Nef在體內(nèi)的致病機制，多種抗HIV1病毒策略被提出，使Nef成為潛在的HIV1靶點.本文試圖構(gòu)建穩(wěn)定表達HIV1型Nef蛋白的SW480細胞系，為研究RNAi在艾滋病治療方面的應用提供細胞模型.

1材料和方法

1.1材料

大腸桿菌TOP10感受態(tài)細菌、pEBMultineomyc質(zhì)粒、pNL43質(zhì)粒、SW480細胞（人結(jié)腸癌細胞）均由本實驗室保存；RNA提取試劑TRIzol和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與NotⅠ購自ThermoFisher公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和去內(nèi)毒試劑購自廣州東盛生物科技有限公司；G418購自Sigma公司；小鼠源Antimyc抗體、內(nèi)參蛋白actin抗體和HRP標記羊抗小鼠IgG均購自Santa Cruz公司；細胞培養(yǎng)所用的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國HyClone公司；其他常規(guī)試劑與耗材均購自于上海生工生物科技有限公司.

1.2引物設計合成

參照pNL43質(zhì)粒上HIV1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0軟件設計的引物如下：Nef正向引物，5′CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC3′；Nef反向引物，5′ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC 3′.分別在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位點和相應的保護堿基，引物由上海生工生物有限公司合成.

1.3HIV1型Nef片段的擴增

以pNL43質(zhì)粒為模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR擴增全長HIV1型Nef基因編碼區(qū)，全長640 bp.PCR擴增體系（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL43質(zhì)粒 1 μL，正向引物和反向引物（10 nmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共進行32個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min.得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，根據(jù)片段大小用DNA純化試劑盒進行切膠回收.

1.4HIV1型Nef真核表達載體構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物和pEBMultineomyc質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶過夜連接后轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)，卡那霉素LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆擴增后，進行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進行酶切和DNA測序鑒定.

1.5重組表達載體的瞬時表達及Western Blot檢測

SW480細胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清和100×青霉素鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養(yǎng)液中，在轉(zhuǎn)染前，將細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，接種量為2×106個細胞，過夜培養(yǎng)使其密度達80%～90%.參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品說明書，將8 μg pEBmycnef重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細胞，以轉(zhuǎn)染空載體pEBMultineomyc質(zhì)粒的SW480細胞為對照，48 h后收集細胞.冰上收獲細胞，經(jīng)裂解后離心取上清，加入上樣緩沖液和DTT煮沸10 min.用10%SDSPAGE膠分離細胞蛋白，上樣20 μg.110 V恒壓80 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上.將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用含5%的脫脂奶粉過夜封閉.再孵育小鼠抗myc的抗體，充分洗膜，隨后孵育HRP標記羊抗小鼠IgG，充分洗膜.然后各取1 mL ECL化學發(fā)光試劑A和B液混勻，5 min后平鋪于膜的蛋白面，〖HJ2.1mm〗通過顯影儀（Tonon公司）顯影拍照.

1.6SW480細胞G418最低致死濃度的測定

將SW480細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng).待細胞密度達到80%后，使用不同濃度G418（0，100， 200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L）的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每天更換培養(yǎng)基，連續(xù)觀察12 d，確定全部細胞死亡的最低濃度，即為最佳的G418Y選濃度.

1.7穩(wěn)定表達Nef基因的SW480細胞株的篩選和鑒定

SW480細胞接種于24孔板，培養(yǎng)16 h，細胞貼壁生長至匯合度達80%時，將0.8 μg pEBmycnef質(zhì)粒在20μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM介導下轉(zhuǎn)染SW480細胞.48 h后將細胞1∶10稀釋轉(zhuǎn)種24孔板，同時加入終濃度為900 mg/L的G418，同時設pEBMultineomyc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照.2～3 d換液1次，待大部分細胞死亡之后，改用450 mg/L G418的培養(yǎng)液維持壓力篩選3周，挑出單個細胞集落，有限稀釋到96孔板進行單克隆篩選，篩選出的單克隆細胞依次于48孔、12孔、6孔板及6 cm和10 cm培養(yǎng)皿擴大培養(yǎng).擴大培養(yǎng)到一定量后，進行冷凍保存.剩余的一些細胞連續(xù)傳代60 d以上（約30代），取一部分細胞進行Nef的RTPCR檢測和Western Blot檢測，確保細胞株的穩(wěn)定性.

2結(jié)果

2.1HIV1 Nef基因PCR擴增結(jié)果

使用PCR方法擴增Nef基因產(chǎn)物，將20 μL PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見1條約640 bp大小的片段（如圖1），片段大小符合預期，說明已成功擴增出HIV1 Nef基因.

2.2真核表達載體pEBmycNef的鑒定

2.2.1轉(zhuǎn)化菌中Nef基因的PCR鑒定將上述過夜連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細胞，卡那霉素LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取4個克隆擴增后，進行菌夜PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，瓊脂糖電泳可見一條約為640 bp大小的Nef目的基因條帶，與預期的條帶大小吻合.

2.2.2重組表達質(zhì)粒pEBmycNef的雙酶切鑒定

重組載體pEBmycNef經(jīng)BamH Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后，瓊脂糖電泳可見一條約為640 bp大小的Nef目的基因條帶，一條為10 223 bp大小的pEBMultineomyc條帶（圖3），說明載體構(gòu)建正確.

PCR擴增的Nef全長DNA序列插入pEBMultineomyc載體，測序結(jié)果與pNL43質(zhì)粒報道的Nef序列相符，表明Nef全長編碼區(qū)DNA成功插入到pEBMultineomyc質(zhì)粒中，且插入方向和閱讀框架均正確.

2.3SW480細胞G418最低致死濃度的測定

使用G418終濃度分別為0～1 000 mg/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SW480細胞，觀察細胞的死亡情況. 實驗發(fā)現(xiàn)，加藥后1 d，細胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯的變化；持續(xù)篩選7 d，大量細胞開始脫落死亡，貼于培養(yǎng)皿底部的細胞逐漸變圓；至12 d，細胞全部死亡（圖4）.確定SW480細胞全部死亡的最低濃度為900 mg/L.

2.4Nef基因在SW480細胞中的瞬時表達

將重組質(zhì)粒pEBmycNef和載體質(zhì)粒pEBMultineomyc分別轉(zhuǎn)染SW480細胞，收集細胞，裂解后上樣進行Western Blot檢測，結(jié)果如圖5所示.重組質(zhì)粒pEBmycNef轉(zhuǎn)染細胞中在約29 000處有特異性條帶，而載體質(zhì)粒pEBMultineomyc轉(zhuǎn)染細胞中沒有，表明HIVl Nef基因在SW480細胞中進行了表達.圖中actin蛋白為內(nèi)參蛋白.

2.5穩(wěn)定表達Nef基因的SW480細胞系的鑒定

pEBmycNef質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細胞后，經(jīng)G418抗性篩選3周后，在顯微鏡下挑選出了4個細胞集落，經(jīng)傳代擴增后，用Western Blot技術(shù)檢測到Nef的表達，而空載對照SW480細胞則未檢測到Nef基因的表達（圖6），并且在連續(xù)傳代60 d后，通過RTPCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)，仍可以檢測到 Nef基因的轉(zhuǎn)錄（圖7）與表達（圖8）.以上結(jié)果表明，已篩選到穩(wěn)定表達HIV1型Nef基因的SW480細胞株.

3討論

RNAi通過降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)來沉默基因這種技術(shù)在生物學研究領域具有極重要的意義，RNAi不僅可以作為基因功能研究與評價的方法工具，它還可以作為一種基因治療的手段.2001年Tusehl研究組開創(chuàng)了RNAi技術(shù)治療人類疾病的新途徑.將RNAi用于病毒性疾病的治療和預防研究取得了一些顯著的效果，比如乙肝病毒（HBV）[13]、丙肝病毒（HCV）[14]、人瘤病毒（HPV）[15]、EB病毒[16].將RNAi應用于艾滋病治療的文獻也不計其數(shù)[17]，這些研究都為HIV1的基因治療提供了很好的參考依據(jù).但是RNAi還無法應用于臨床治療艾滋病，阻礙這一進程的是RNAi的傳遞模式.

2006年，向雙林等提出利用修改過的非治病性細菌在體內(nèi)及體外定向傳遞shRNA到靶細胞中以發(fā)揮干擾作用.他們將這種依賴細菌進行的RNAi傳遞技術(shù)稱之為TransKingdom RNAi （tkRNAi）[18].該研究的最終目的是將這種依賴細菌進行的RNAi傳遞技術(shù)應用到干擾艾滋病病毒的基因研究中，試圖探尋更有效的RNAi傳遞方法，為將RNAi應用到臨床上治療艾滋病提供理論依據(jù).由于HIV病毒基因的RNAi干擾實驗在體內(nèi)無法進行，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達HIV1型病毒蛋白的細胞模型顯得至關(guān)重要.

本實驗從pNL43質(zhì)粒上擴增出Nef基因，隨后與pEBMultineomyc質(zhì)粒共同經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化構(gòu)建成pEBmycnef真核表達質(zhì)粒.通過菌液PCR驗證、雙酶切驗證和DNA測序分析證明nef全長編碼區(qū)DNA成功插入到pEBMultineomyc質(zhì)粒中，且插入方向和閱讀框架均正確.利用 LipofectamineTM 2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細胞，培養(yǎng)48 h后，裂解細胞，收集蛋白，利用Western Blot技術(shù)檢測到 Nef蛋白的瞬時表達.然后利用G418篩選建立穩(wěn)定表達細胞系的方法，首次建立了穩(wěn)定表達HIV1型Nef基因的SW480細胞系，為研究tkRNAi在艾滋病治療方面的應用提供了細胞模型.

⒖嘉南祝

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第8篇：基因重組范文

【關(guān)鍵詞】 急性心肌梗死；心力衰竭；基因重組人腦利鈉肽

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.17.053

心力衰竭在21世紀已經(jīng)成為醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的重點關(guān)注疾病， 在過去的40年中， 心力衰竭死亡患者數(shù)量出現(xiàn)了急劇增加。并且心力衰竭患者集中在中老年， 心力衰竭作為一種較為嚴重的心內(nèi)科病癥， 其常見致病疾病為心肌梗死， 患者出現(xiàn)急性心肌梗死后會進一步出現(xiàn)心臟排血量的異常， 同時患者的組織器官灌注不足， 從而導致患者出現(xiàn)瘀血綜合征[1]。本研究就本院接診的急性心肌梗死合并心力衰竭患者進行分組， 探究基因重組人腦利鈉肽的應用效果?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年9月～2016年9月在心內(nèi)科掛號住院診治的急性心肌梗死合并心力衰竭患者80例作為研究對象， 所有患者均已確診病情， 患者服用硝酸甘油不能有效緩解病情， 同時患者的心電圖檢查顯示有兩個及以上的ST段抬高， 患者的心肌損傷標志物升高， 同時排除有心源性的休克以及收縮壓

兩組患者年齡、性別等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 對照組患者在治療中實施常規(guī)治療， 對患者進行常規(guī)抗血小板凝集、斑塊穩(wěn)定以及心肌重塑逆轉(zhuǎn)治療， 患者的硝酸甘油起始劑量為5 μg/（kg?min）， 患者每10分鐘進行劑量調(diào)整， 保證患者的血壓穩(wěn)定， 對患者進行連續(xù)的靜脈滴注， 同時對有溶栓指標的患者進行阿替普酶的靜脈滴注[3]。觀察組患者則應用基因重組人腦利鈉肽進行治療， 其首次負荷劑量為1.5 μg/kg， 進行勻速靜脈滴注， 然后進行持續(xù)的靜脈滴注， 持續(xù)3 d， 維持劑量為0.0075 μg/（kg?min）， 在此過程中要保證患者的血壓穩(wěn)定。

1. 3 觀察指標及療效判定標準 對比兩組患者的臨床治療效果以及患者治療后的尿量、左室射血分數(shù)。療效判定標準[4]：顯效：患者的心功能改善≥2級；有效：患者的心功能改善1級；無效：患者的心功能改善

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P

2 結(jié)果

^察組治療顯效12例、有效24例、無效4例， 總有效率為90.0%；對照組治療顯效9例、有效16例、無效15例， 總有效率為62.5%。觀察組患者臨床治療總有效率明顯高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學意義（P

3 討論

急性心肌梗死是由于冠狀動脈內(nèi)部出現(xiàn)不穩(wěn)定斑塊的破裂， 導致冠狀動脈內(nèi)部受到刺激而出現(xiàn)血小板凝集的血栓， 隨著血栓的累積堵塞管腔， 導致患者的管腔狹窄或者閉塞， 從而引發(fā)心肌缺血和供氧不足。相關(guān)研究指出對于心肌梗死患者其梗死面積越大則心肌的收縮能力越差， 患者的狀況越差， 導致心臟功能出現(xiàn)衰竭， 患者很容易引發(fā)呼吸困難以及肺水腫等合并癥， 病情控制不當很容易引發(fā)心力衰竭， 對患者的生命安全帶來巨大威脅。腦利鈉肽是上世紀從豬腦組織中提取出來并檢測到的一種內(nèi)源性激素， 是由左心室的心肌細胞合成并分泌， 其具有較為明顯的利尿降血壓作用。在心力衰竭患者體內(nèi)， 其腦鈉肽的分泌有出現(xiàn)代償性增加， 對患者的心臟功能進行代償性增強[5]。

本研究結(jié)果顯示， 觀察組治療總有效率為90.0%， 高于對照組的62.5%， 差異具有統(tǒng)計學意義（P

總之， 急性心肌梗死合并心力衰竭患者在臨床診治過程中應用基因重組人腦利鈉肽治療對患者的病癥有很好的改善， 同時提升治療效果， 值得在臨床治療中推廣應用。

參考文獻

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第9篇：基因重組范文

【摘要】 目的：觀察ompL17基因表達產(chǎn)物的免疫原性以及該表達蛋白在動物模型中的分布情況。方法：提取鉤端螺旋體017株基因組DNA，擴增出ompL17基因，與表達載體pGEX4T1重組，誘導表達OMPL17蛋白，分析該基因在017株中體外不同溫度的表達情況。結(jié)果：PCR和酶切分析證實構(gòu)建成功了表達載體，SDSPAGE分析證實誘導表達出OmpL17蛋白；體外不同溫度下發(fā)現(xiàn)該基因不表達蛋白。結(jié)論：成功表達出ompL17基因的蛋白，體外不同溫度未發(fā)現(xiàn)該蛋白的表達，為賴型鉤體的分子機制的闡明奠定了基礎。

【關(guān)鍵詞】 鉤端螺旋體；克隆；表達；體內(nèi)分布

鉤端螺旋體病（簡稱鉤體?。┦怯摄^端螺旋體引起的一種人獸共患自然免疫源性疾病，嚴重危害人類的健康和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)。賴型鉤體56601和哥本哈根型的測序完成[1，2]為鉤體基因組學及其功能蛋白學的研究提供了一個新的契機。ompL17基因作為本研究室從賴型鉤體強毒株中獨立獲得的基因，經(jīng)過基因打靶技術(shù)初步斷定為毒力相關(guān)基因。生物信息學分析結(jié)果表明，OmpL17屬于外膜蛋白，可能與鉤體毒力相關(guān)。因此選擇ompL17基因進行克隆表達，分析其在大腸桿菌中的表達以及賴型鉤體017株中不同溫度下的表達研究，探討該基因是否體內(nèi)誘導表達，將有助于鉤體致病的分子機理的解釋。

1 材料與方法

1.1材料

問號鉤端螺旋體賴型017株（Leptospira interrogans serovar Lai strain 017）由成都生物制品所提供，本室保存，連續(xù)在豚鼠中傳代培養(yǎng)以保持毒力。實驗用菌株于Kornthof培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d，菌數(shù)達1010條。pGEX4T1載體購自PROMEGA 公司，大腸桿菌JM109株由本室保存。限制性內(nèi)切酶BamHI、HindⅢ，T4 DNA連接酶、牛小腸堿性磷酸酶、MassRulerTM DNA Ladder、蛋白質(zhì)分子量標準均為MBI公司產(chǎn)品；ELISA 檢測試劑盒由晶美生物工程有限公司。BCA Protein Assay Reagent Kit為PIERCE公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分裝（分析純）。

1.2方法

1.2.1 引物設計參照ompL17基因全序列設計鉤體ompL17基因，P1：5’ GTC GGA TCC CGT ATG ACC CTA GAG TCC TTG–3’；P2：5’ GCG GAA TTC GTT TAT CAA AAA GGC CAT CG3’，序列中引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點 。

1.2.2鉤體ompL17基因的擴增回收、酶切及純化：參見Terpstra 等方法[3]并稍作修改進行鉤體基因組DNA的提取與純化。以純化的鉤體017株基因組DNA為模板，反應體系如下: 模板2 μl，Taq 0.5 μl，dNTP 4.0 μl，P1 1.0 μl，P2 1.0 μl，Sterile H2O 38.5 μl，10×PCR buffer 5.0 μl。循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30sec，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30循環(huán)，72 ℃延伸6 min。擴增產(chǎn)物電泳鑒定后以PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Roche）純化回收，操作程序參照試劑盒說明書。然后用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切該產(chǎn)物，純化后備用。

1.2.3 重組表達載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pGEX 4T1的連接及轉(zhuǎn)化[4]：提取質(zhì)粒pGEX 4T1，加入BamHⅠ和EcoRⅠ37 ℃進行雙酶切，純化后與同樣酶切過的ompL17基因混合，在T4連接酶作用下連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，取轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布于含氨芐青霉素50 μg/ml LB平板上培養(yǎng)過夜。重組質(zhì)粒的篩選與鑒定：從轉(zhuǎn)化后生長后的平板上挑取白色單菌落于含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中增殖后提取質(zhì)粒DNA，通過酶切分析、PCR擴增鑒定以及測序篩選出正確重組子。

1.2.4重組質(zhì)粒pGSTOmpL17在大腸桿菌中的誘導表達分別挑取含空質(zhì)粒pGEX4T1和含重組質(zhì)粒pGSTompL17的菌落接種于LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，次日取菌液按比例接種于LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2小時后加入IPTG至終濃度1 mmol/L，在誘導前及誘導后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時收集菌液，菌體懸于含溶菌酶的PBS中，經(jīng)反復凍融裂解細菌至菌液清亮，取裂解液上清、沉淀及收集的細菌培養(yǎng)液進行SDSPAGE電泳，分析OmpL17蛋白的表達量及表達形式。

1.2.5賴型鉤體在體外不同溫度OmpL17蛋白表達分析[5]賴型鉤體017和雙曲鉤體PatocⅠ培養(yǎng)好后，將賴型鉤體017放在28 ℃、30 ℃和37 ℃三種溫度條件進行培養(yǎng)24小時，然后將上述鉤體離心分鐘集菌。菌液沉淀用PBS洗滌，再用離心收集沉淀。將沉淀用PBS溶解，用純化蛋白做陽性對照，用PatocⅠ做陰性對照，SDSPAGE操作同前，電泳后的凝膠利用半干法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。TTBS洗膜后加入含辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG的TTBS液中孵育后再用TTBS洗膜，加入底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）液顯色，直至有條帶出現(xiàn)時用蒸餾水洗滌終止反應。

2結(jié)果

2.1 ompL17基因的PCR擴增及序列測定

以賴型017株為模板，用引物P1、P2在適宜條件擴增出約900bp左右的特異片段見Fig.1。

2.2pGEX 4T1質(zhì)粒DNA的提取與純化

堿裂解法提取pGEX 4T1質(zhì)粒，電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒DNA有超螺旋、線性、環(huán)狀三種形式的條帶出現(xiàn)，無蛋白和RNA的污染（Fig.2）。

2.3 重組質(zhì)粒的克隆及鑒定

賴型鉤體基因ompL17的PCR片段與載體pGEX 4T1質(zhì)粒純化后經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，連接酶作用下經(jīng)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，挑取菌落在LB中培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，以凝膠電泳初步檢測比pGEX 4T1 DNA分子量大的質(zhì)粒。酶切分析顯示BamH I 和EcoR I雙酶切產(chǎn)生4.9 kb和900 bp 兩條酶切條帶提示該重組質(zhì)粒已包含-900 bp的插入片段（圖3）。以該重組質(zhì)粒pGSTOmpL17為模板，以引物P1、P2進行PCR擴增，能擴出約900 bp條帶，而以空質(zhì)粒為模板未擴出相應條帶，進一步證實重組質(zhì)粒pGSTompL17構(gòu)建成功（圖4）。

2.4 重組質(zhì)粒pGSTOmpL17在大腸桿菌中的融合表達

在變性聚丙烯酰胺凝膠上，經(jīng)IPTG誘導的pGEX4T1表達產(chǎn)物在26KD處出現(xiàn)GST蛋白帶，而未經(jīng)IPTG誘導的pGEX4T1沒有26KD條帶出現(xiàn)；經(jīng)IPTG誘導的pGSTompL17表達產(chǎn)物在54KD處出現(xiàn)濃的蛋白帶。用不同劑量IPTG和改變IPTG誘導時間，可提高融合蛋白的表達量。SDSPAGE 結(jié)果見Fig.5。

2.5 賴型鉤體017在體外不同溫度OmpL17蛋白表達分析

分別取賴型鉤體017株在28 ℃、30 ℃、37 ℃三種溫度下表達蛋白和patoc在28 ℃表達蛋白和陽性對照進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜和Western–blotting檢測，結(jié)果陽性對照在約54KDa處檢測到陽性雜交信號，而賴型鉤體56601和patoc無雜交信號（Fig.6）。

3討論

鉤端螺旋體外膜研究一直是鉤體分子生物學研究的重點和熱點。但是，目前鉤體外膜在致病過程中的作用機制仍不十分清楚。1993年，外膜蛋白的研究才有報道，首先Haake等從外膜蛋白純化分離入手，克隆測序了外膜蛋白OmpL1[6]，以后幾個膜脂蛋白LipL41[7]，LipL36[8]，LipL32[9] 用同樣的方法得到分離。研究表明這幾個外膜蛋白可能與鉤體致病和免疫保護有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明ompL17基因可以進行重組表達，但是該基因在賴型鉤體017中體外不同溫度下的蛋白表達情況表明，該基因在賴型鉤體017的培養(yǎng)液中在28 ℃、30 ℃、和37 ℃培養(yǎng)都不表達，結(jié)合本研究者已做的免疫組織化學染色結(jié)果表明該蛋白在賴型鉤體中是體外不表達而是在體內(nèi)誘導表達的蛋白質(zhì)。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)確認的鉤體毒力因子為鉤體的溶血素蛋白，同時溶血素[10]有三種類型：酶類，成孔蛋白類和表面活性劑類。問號狀賴型鉤體測序完成后[1]，通過全基因組ORF分析，發(fā)現(xiàn)9個基因與GenBank/NCBI或EMBL數(shù)據(jù)庫中登錄的溶血素基因相似或者相同。目前已發(fā)現(xiàn)[11]鉤體的又一種新的溶血素基因，它是鞘磷脂酶樣的蛋白質(zhì)，同時發(fā)現(xiàn)它是鉤體體內(nèi)誘導表達的蛋白質(zhì)，而鉤體在體外培養(yǎng)不表達該蛋白質(zhì)，還發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)對馬肺內(nèi)皮細胞有細胞毒性，同時對馬和兔的紅細胞有一定的溶血活性。OmpL17作為一種在體內(nèi)誘導表達蛋白質(zhì)，或許在鉤體致病過程中起著重要作用，但是其在鉤體致病中的具體作用以及是否與鉤體是否相關(guān)有待于進一步的分析和探討。

參考文獻

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