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【關(guān)鍵詞】農(nóng)田;重金屬污染;生物修復(fù)
0 前言
近年來(lái),我國(guó)食品安全形式非常嚴(yán)峻,有一部分原因就是農(nóng)田遭到污染,尤其是重金屬污染。據(jù)報(bào)道,目前我國(guó)受砷、鉻、鉛等重金屬污染的耕地而積近2000萬(wàn)平方千米,約占總耕地而積的20%;其中工業(yè)“三廢”污染耕地1000萬(wàn)平方千米,污水灌溉達(dá)330多萬(wàn)平方千米。重金屬不能被土壤微生物所分解,易在土壤中蓄積或轉(zhuǎn)化為毒性更大的化合物。土壤重金屬污染的特點(diǎn)為長(zhǎng)期累積效應(yīng)、隱蔽性、不可逆性和一定的交互作用。土壤受重金屬污染后,影響農(nóng)作物并通過(guò)食物鏈等影響人體健康,造成中毒危害。另?yè)?jù)國(guó)土資源部的最新調(diào)查顯示:每年我國(guó)約有1200萬(wàn)噸糧食被重金屬所污染,這些糧食足夠養(yǎng)活4000萬(wàn)左右的人口,并且這種污染問(wèn)題日益嚴(yán)重。因此,對(duì)農(nóng)田重金屬污染的治理顯得尤為迫切。當(dāng)前,土壤重金屬污染的治理方法主要有工程措施、物理化學(xué)方法、化學(xué)修復(fù)方法、以及生物修復(fù)方法。本文將重點(diǎn)介紹生物修復(fù)法在農(nóng)田重金屬污染治理中的研究進(jìn)展,同時(shí)對(duì)生物修復(fù)法治理農(nóng)田重金屬污染的研究前景進(jìn)行展望。
1 簡(jiǎn)介
生物修復(fù)法是指利用生物的生命代謝活動(dòng)降低環(huán)境中有毒有害物質(zhì)的濃度或使其完全無(wú)害,從而使污染的土壤局部地或完全地恢復(fù)到原始狀態(tài)。其優(yōu)點(diǎn)有:成本低、不破壞土壤生態(tài)環(huán)境、可以回收再利用貴金屬、造成二次污染機(jī)會(huì)較少。缺點(diǎn)有:周期長(zhǎng)、一種植物一般只能提取一種或者幾種重金屬、而植物固定只是將重金屬暫時(shí)固定,如果土壤環(huán)境發(fā)生變化,重金屬的毒性作用還有可能再次出現(xiàn)[1]。
2 生物修復(fù)法的分類(lèi)
生物修復(fù)作用治理農(nóng)田重金屬污染方法可以分為動(dòng)物修復(fù)法、植物修復(fù)法以及微生物修復(fù)法。它們有著不同的優(yōu)缺點(diǎn)。因此,在利用生物技術(shù)處理重金屬污染時(shí),要結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際,因地制宜,才能達(dá)到預(yù)期效果。
2.1 動(dòng)物修復(fù)
動(dòng)物修復(fù)是指土壤動(dòng)物群通過(guò)直接的吸收、轉(zhuǎn)化和分解或間接的改善土壤理化性質(zhì),提高土壤肥力,促進(jìn)植物和微生物的生長(zhǎng)等作用而修復(fù)土壤污染的過(guò)程。有關(guān)動(dòng)物修復(fù)的研究報(bào)道較少,主要集中在有機(jī)物和農(nóng)藥污染土壤的修復(fù)(如利用蚯蚓等修復(fù))和富營(yíng)養(yǎng)化水體的修復(fù)(如利用濾食性貝類(lèi)、棘皮動(dòng)物、河蟹等修復(fù)),對(duì)重金屬污染土壤的動(dòng)物修復(fù)機(jī)理仍處于探索階段[2]。
2.2 微生物修復(fù)
利用土壤微生物的蓄積和降解作用來(lái)治理土壤重金屬污染是一種高效的途徑。國(guó)內(nèi)外許多研究己證明,菌根在修復(fù)遭受重金屬污染的土壤方面發(fā)揮著特殊的作用,他們減輕了植物在重金屬污染的土壤中的受害程度[3]。
土壤重金屬污染的微生物修復(fù)是利用微生物的生物活性對(duì)重金屬的親和吸附或轉(zhuǎn)化為低毒產(chǎn)物,從而降低重金屬的污染程度[4]。利用微生物(藻類(lèi)、細(xì)菌和酵母等)來(lái)減輕或消除重金屬污染,雖然微生物不能降解和破壞重金屬,但是可以通過(guò)改變它們的物理或化學(xué)特性而影響金屬在環(huán)境中的遷移和轉(zhuǎn)化。其修復(fù)機(jī)理包括表面生物大分子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞代謝、空泡吞飲、生物吸附和氧化還原反應(yīng)等。微生物對(duì)上壤中重金屬活性的影響主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①溶解和沉淀作用;②生物吸附和富集作用;③氧化還原作用。微生物修復(fù)技術(shù)種類(lèi)繁多,可進(jìn)行異位修復(fù)、原位修復(fù)以及原位/異位聯(lián)合修復(fù)。其中,原位修復(fù)操作簡(jiǎn)單,對(duì)原有的土壤環(huán)境破壞程度低。微生物修復(fù)受各種環(huán)境因素的影響較大,氧氣、pH、溫度、水分等均可影響微生物活性進(jìn)而影響修復(fù)效果,其田間試驗(yàn)效果不是非常理想。因此,為降解菌提供適宜條件以促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖至關(guān)重要,這也是今后研究的重點(diǎn)。
2.3 植物修復(fù)
植物修復(fù)技術(shù)是指通過(guò)植物自身及共存微生物體系,修復(fù)和消除由無(wú)機(jī)廢棄物和有機(jī)毒物造成的土壤環(huán)境污染的一種技術(shù)。
我國(guó)野生植物資源豐富,生長(zhǎng)在天然的污染環(huán)境中的耐重金屬植物和野生超積累植物數(shù)不勝數(shù)。因此開(kāi)發(fā)與利用這些野生植物資源對(duì)植物修復(fù)的意義十分重大。有關(guān)資料表明,大量植物對(duì)重金屬Cr,Cd,Co,Pb,Ni,Cu,Zn等有很強(qiáng)的吸收積累能力。比如國(guó)內(nèi)有人利用白菜修復(fù)重金屬污染土壤,如叢孚奇等將白菜用于鑰礦區(qū)重金屬污染土壤的修復(fù)研究,結(jié)果表明磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液能顯著提高白菜的地上部富集土壤中重金屬元素的能力。李玉雙[5]等以沈陽(yáng)張士灌區(qū)重金屬污染上壤為修復(fù)對(duì)象,采用盆栽試驗(yàn),研究了乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)白菜富集重金屬及其生長(zhǎng)狀況的影響。結(jié)果表明,EDTA能夠提高白菜對(duì)上壤中Cu,Cd,Pd 和Zn的植物提取效率。
但是,由于超富集植物一般只能積累某些重金屬元素,植物物種的選取受到不同地理氣候條件的限制,同時(shí)富集植物和超富集植物生物量一般較少,生長(zhǎng)速度慢,積累效率低。所以,利用野生抗性植物進(jìn)行重金屬污染土壤的治理還未取得理想結(jié)果。這就需要相關(guān)科研人員做進(jìn)一步深入的研究,以求早日獲得生長(zhǎng)周期短,能吸附多種重金屬,積累效率高的重金屬富集吸收植物。
2.4 綜合修復(fù)技術(shù)
由于每個(gè)地區(qū)的污染物來(lái)源不同造成各地污染情況有很大的差異。只用一種修復(fù)技術(shù)往很難達(dá)到目標(biāo)。因此,開(kāi)發(fā)復(fù)合修復(fù)方法成為土壤重金屬污染修復(fù)的主要研究方向[6]?,F(xiàn)今開(kāi)始投入應(yīng)用的復(fù)合修復(fù)技術(shù)的主要類(lèi)型有動(dòng)物/植物聯(lián)合修復(fù)、化學(xué)/物化一生物聯(lián)合修復(fù)以及植物/微生物聯(lián)合修復(fù)。
3 展望
生物修復(fù)技術(shù)治理重金屬污染土壤以其低成本、高效率、適用范圍廣和無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)已成為重金屬污染農(nóng)田土壤治理中的一個(gè)全新研究領(lǐng)域和國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。但是由于其起步晚,難度大,其大部分研究還處于實(shí)驗(yàn)室階段,尚不能有效地應(yīng)用于重金屬農(nóng)田污染的治理中去,但隨著不同學(xué)科(遺傳學(xué)、土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)、化學(xué)、生理學(xué)、環(huán)境保護(hù)學(xué)和生物工程)的相互配合。我們相信該技術(shù)會(huì)日趨成熟,并且為重金屬污染農(nóng)田的治理貢獻(xiàn)出巨大的力量。
【參考文獻(xiàn)】
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隨著生物技術(shù)的發(fā)展,多肽類(lèi)藥物在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,相應(yīng)的制劑學(xué)研究也日益受到重視。與傳統(tǒng)小分子有機(jī)藥物相比,多肽具有穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短和生物膜透過(guò)性差等特點(diǎn)。在我國(guó),重組人生長(zhǎng)激素主要用于兒童內(nèi)源性生長(zhǎng)激素缺乏引起的矮小癥、Turner綜合癥、成人GHD、燒傷及創(chuàng)傷的修復(fù)等治療。隨著臨床研究的深入,其在抗衰老、骨質(zhì)疏松和心血管疾病的治療方面亦顯示有很好的療效。近年來(lái),重組人生長(zhǎng)激素相關(guān)研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一,研究范圍從工程菌培養(yǎng)、生產(chǎn)、發(fā)酵、純化、凍干,一直延伸到制劑的改良和穩(wěn)定性提高等。本文就重組人生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性研究進(jìn)展作一綜述。
1 人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)特性和生理作用
人生長(zhǎng)激素(hGH)是由腦垂體前葉分泌的一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)激素,含191個(gè)氨基酸殘基,分子量為22 KDa,有兩個(gè)二硫鍵,無(wú)糖基化,是人出生后促生長(zhǎng)的最重要激素,有很強(qiáng)的種屬特異性。hGH是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,能影響幾乎所有的組織類(lèi)型和細(xì)胞,甚至包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng),其主要作用是刺激骨、軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝。hGH發(fā)揮功能作用主要經(jīng)由兩個(gè)途徑:一是誘導(dǎo)肝細(xì)胞、肌細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)激素介質(zhì)(somatomedin,SM),再經(jīng)由SM間接起作用;二是直接作用于靶細(xì)胞產(chǎn)生生理效應(yīng)。無(wú)論何種途徑,hGH都需要首先同細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合,再由受體介導(dǎo),激發(fā)一系列生化反應(yīng)并最終產(chǎn)生生物效應(yīng)。hGH的基本功能是刺激所有機(jī)體組織的發(fā)育,增加體細(xì)胞的大小與數(shù)量,hGH的這種促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的基礎(chǔ)是促進(jìn)合成代謝。
2 引起重組人生長(zhǎng)激素不穩(wěn)定的因素及其物理、化學(xué)不穩(wěn)定性
重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)是一種不穩(wěn)定的蛋白藥物,暴露在生理環(huán)境中或與有機(jī)溶劑接觸易發(fā)生聚集,形成可溶性和不溶性的蛋白聚集體。一些物理因素如劇烈攪拌、冷凍干燥和射線(xiàn)輻照等也都會(huì)加速rhGH聚集。溫度和pH值是影響rhGH穩(wěn)定性的最重要的因素。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,很難總結(jié)出溫度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能影響的普遍機(jī)理。一般來(lái)說(shuō),溫度越高,穩(wěn)定性越差。蛋白質(zhì)和多肽都是兩性電解質(zhì),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于極端pH值時(shí),分子間靜電排斥增加,引起蛋白質(zhì)折疊,這一過(guò)程會(huì)導(dǎo)致電荷密度降低,即降低靜電自由能。極端的pH值會(huì)降低鹽橋(salt bridge)的形成能力,這也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低。此外,天然結(jié)構(gòu)與去折疊狀態(tài)內(nèi)帶電基團(tuán)的pKa值不同,pH值的改變會(huì)影響帶電基團(tuán)的性質(zhì),導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變。
多肽和蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性可以分為兩種情況,即物理不穩(wěn)定性和化學(xué)不穩(wěn)定性。最常見(jiàn)的物理不穩(wěn)定性是聚合。最常見(jiàn)的化學(xué)反應(yīng)包括以下幾種:1)脫酰胺反應(yīng)。在脫酰胺反應(yīng)中,Asn/Gin殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脫酰胺反應(yīng)與環(huán)境條件和多肽的結(jié)構(gòu)有關(guān),提高pH值、升高溫度都將有利于脫酰胺反應(yīng)的進(jìn)行。2)氧化。多肽溶液易氧化的主要原因有兩種,一是溶液中有過(guò)氧化物的污染,二是多肽的自發(fā)氧化。在所有的氨基酸殘基中,Met、Cys和His、Trp和Tyr等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對(duì)氧化也都有影響。3)水解。多肽中的肽鍵易水解斷裂,由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂。4)形成錯(cuò)誤的二硫鍵。二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發(fā)生交換可形成錯(cuò)誤的二硫鍵,導(dǎo)致三級(jí)結(jié)構(gòu)改變和活性喪失。5)消旋。除Gly外,所有氨基酸殘基的(3C碳原子都是手性的,易在堿催化下發(fā)生消旋反應(yīng)。6)β消除。β消除是指氨基酸殘基中β碳原子上基團(tuán)的消除。Cys、Set、Thr、Phe和TYr等殘基都可通過(guò)消除降解。在堿性pH下易發(fā)生B消除,溫度和金屬離子對(duì)其也有影響。
3 提高重組人生長(zhǎng)激素穩(wěn)定性的途徑
3.1 化學(xué)修飾
目前研究最多的是聚乙二醇(PEG)修飾。PEG是一種水溶性高分子化合物,在體內(nèi)可降解,無(wú)毒。PEG與多肽結(jié)合后能提高熱穩(wěn)定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。選擇合適的修飾方法和控制修飾程度可保持或提高原生物活性。通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)可對(duì)修飾結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
3.2 使用添加劑
穩(wěn)定蛋白質(zhì)類(lèi)藥物常加入的輔料有糖類(lèi)、多元醇、表面活性劑、鹽、氨基酸和大分子化合物等。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質(zhì)周?chē)?,從而提高多肽的穩(wěn)定性;表面活性劑可降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力,抑制蛋白質(zhì)在疏水性表面的聚集、沉淀和吸附或阻止蛋白質(zhì)的化學(xué)降解;鹽類(lèi)可以起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用,也可以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,這主要取決于鹽的種類(lèi)、濃度、離子相互作用的性質(zhì)及蛋白質(zhì)的電荷;一些氨基酸單獨(dú)或與其它輔料并用,通過(guò)優(yōu)先排除機(jī)制穩(wěn)定蛋白質(zhì),在凍干過(guò)程中,上述物質(zhì)還可以取代水而與多肽形成氫鍵來(lái)穩(wěn)定多肽的天然構(gòu)象,而且還可以提高凍干制品的玻璃化溫度;大分子化合物穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用機(jī)制可能包括大分子的表面活性、優(yōu)先排除、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用的空間隱蔽度提高、限制蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)及優(yōu)先吸附等。白蛋白(HSA)是穩(wěn)定蛋白質(zhì)常用的大分子物質(zhì),羥丙基β-環(huán)糊精(HP-p-CD)也是較有前途的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
此外,一些二價(jià)金屬離子如鈣、鎂、鋅和鈷等通過(guò)配位作用容易與蛋白質(zhì)結(jié)合,使整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊實(shí)和穩(wěn)定,從而使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。使用不同的測(cè)試手段,如熱力學(xué)法和凝膠法可測(cè)試金屬離子和生長(zhǎng)激素的結(jié)合部位。生長(zhǎng)激素中的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基可能是生長(zhǎng)激素中的金屬結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于金屬離子對(duì)生長(zhǎng)激素的影響可采用多種方法從不同角度去測(cè)量,如用差熱法去檢測(cè)鈣離子對(duì)重組人生長(zhǎng)激素的影響,用熱穩(wěn)定性檢測(cè)鎂離子對(duì)于生長(zhǎng)激素的作用,測(cè)試鈷離子的金屬鍵對(duì)生長(zhǎng)激素的影響”等。結(jié)果表明,金屬離子確實(shí)使生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性有所提高,但是其反應(yīng)的機(jī)理和過(guò)程尚不明確,而且,對(duì)于測(cè)量方法也沒(méi)有最佳的評(píng)價(jià)方法,每個(gè)方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。
3.3 其它
多肽發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)如脫酰胺、消除和水解等都需要水參與,水含量降低還可使多肽的變性溫度升高,因此,使用凍干技術(shù)可提高多肽的穩(wěn)定性。此外,通過(guò)使用生物降解材料,如聚乙交酯-丙交酯、乳酸羥基乙酸共聚物等制備重組人生長(zhǎng)激素微球可達(dá)到較好的釋放效果并提高其穩(wěn)定性。通過(guò)基因工程手段替換引起多肽不穩(wěn)定的殘基或引入能增加多肽穩(wěn)定性的殘基可提高多肽的穩(wěn)定性。
4 重組人生長(zhǎng)激素的分析檢測(cè)
rhGH屬于多肽類(lèi)藥物的一種,其檢測(cè)方法與多肽類(lèi)藥物相同。常用方法主要有高效液相色譜(HPLC)、
毛細(xì)管電泳(HPCE)、質(zhì)譜、凝膠電泳等法。檢測(cè)目的主要包括等電點(diǎn)測(cè)定(CIEF技術(shù))、分子量測(cè)定(SDS―PAGE和SDS―CGE)、穩(wěn)定性研究(HPCE輔以基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜法)、氨基酸組成分析(Edman酶解、化學(xué)降解法或直接多肽特異酶解后經(jīng)HPCE和HPLC分離進(jìn)入氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行序列測(cè)定)以及結(jié)構(gòu)分析(質(zhì)譜、核磁共振、傅立葉紅外轉(zhuǎn)換光譜、圓二柱色譜)等。
4.1 高效液相色譜
HPLC法是檢測(cè)多肽組分含量、純度最常用和最成熟的一種方法。其中,反相色譜柱對(duì)多肽類(lèi)藥物的分析占高效液相色譜分析的80%以上。
4.2 毛細(xì)管電泳
HPCE主要用于多肽純度的鑒定。與HPLC法相比,HPCE具有更高的分辨率和靈敏度,某些純化的多肽在凝膠電泳和HPLC上鑒定純度為100%,但用HPCE分析純度僅90%。同時(shí),HPCE法的進(jìn)樣量也更少。
4.3 DSC熱差分析儀
使用熱差分析儀可對(duì)蛋白質(zhì)藥物的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析。
4.4 快原子轟擊質(zhì)譜
快原子轟擊質(zhì)譜是準(zhǔn)確測(cè)定多肽物質(zhì)分子量的有效方法。由于不易獲得碎片峰,其在測(cè)定多肽順序上有困難,應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜可解決這一問(wèn)題。通過(guò)快原子轟擊質(zhì)譜確定多肽分子量,在此基礎(chǔ)上通過(guò)活化碰撞(CA)技術(shù)可對(duì)氨基酸序列進(jìn)行識(shí)別。
4.5 電噴霧電離質(zhì)譜
電噴霧電離質(zhì)譜依靠強(qiáng)電場(chǎng)使分子電離。電噴霧技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用,不僅能測(cè)定生物分子的分子量,而且能確定多肽和蛋白質(zhì)的序列信息。
4.6 基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)
基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、質(zhì)量分辨率高和測(cè)定質(zhì)量范圍寬等特點(diǎn),非常適合生物分子和高聚物的分子量測(cè)定。
4.7 核磁共振
核磁共振(NMR)可用于確定氨基酸序列,并可對(duì)混合物中的各組分含量進(jìn)行分析。
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