單細胞研究精選(九篇)
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第1篇：單細胞研究范文
利用哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)重組蛋白技術(shù)已成為生物制藥領域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一,并以其研究的深入和進展推動生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。專家預言:蛋白治療藥物如糖蛋白,抗體和多肽藥物僅僅只是開始進入市場,預計在下一個10 年或20 年會有一個更為快速的發(fā)展。蛋白治療藥物的迅速增長和市場需求已遠遠超過目前全世界的生產(chǎn)能力。
哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白中，開始常用的細胞系有CHO和HEK293兩大類細胞。使用較多的COS細胞，由于其強烈的貼壁作用，曾經(jīng)限制了大規(guī)模懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的實際應用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，CHO細胞可以貼壁培養(yǎng)，也可以經(jīng)過馴化懸浮培養(yǎng)，是生產(chǎn)包括基因工程抗體藥物（人源化或人源抗體）在內(nèi)的重組糖蛋白的首選工具細胞。HEK293細胞主要用于蛋白瞬時表達及腺病毒生產(chǎn)，尚未見以HEK293表達的藥物獲得批準。目前，正在進行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)的研發(fā)中的哺乳動物細胞株還有猿細胞衍生的Vero，Vero細胞是依賴于貼壁培養(yǎng)的細胞，主要用于病毒疫苗的生產(chǎn)；SP2/0和NS0主要用于制備雜交瘤細胞，生產(chǎn)鼠單抗，也有用來生產(chǎn)人源化單抗的報道；以及人的胚胎干細胞等。
建立和優(yōu)化高效的表達載體系統(tǒng)是重組蛋白在哺乳動物細胞生產(chǎn)的關(guān)鍵，是抗體產(chǎn)業(yè)化的前提和瓶頸，是提高重組蛋白在單細胞中的表達量的基礎。人工構(gòu)建的哺乳動物細胞表達載體為穿梭載體，含有原核基因序列：大腸桿菌復制子及抗生素抗性基因等，這樣便于載體在原核細胞中擴增和大量制備。另外含有能使外源基因在哺乳動物細胞中有效轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子元件，以及終止子和加polyA信號序列。目前常見的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)主要有二氫葉酸還原酶基因擴增系統(tǒng)及GS基因拷貝擴增系統(tǒng)，但是這兩種擴增系統(tǒng)所需時間為6~12個月，蛋白的表達不能在早期得以預測，是此表達系統(tǒng)的限速步驟。造成限速的原因是由于基因的沉默現(xiàn)象產(chǎn)生了特定基因的轉(zhuǎn)錄降低或取消。導致基因沉默的主要原因是目的基因所插入位點染色體的結(jié)構(gòu)。異染色質(zhì)區(qū)DNA較濃縮，轉(zhuǎn)錄不活躍，而常染色區(qū)較松馳，轉(zhuǎn)錄活躍。國外最近一直在發(fā)展一次性表達的技術(shù)，以此來達到提速和優(yōu)化的目的，方式一是通過在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平的修飾改構(gòu)，如MARS、STARS和UCOS等序列的添加；方式二是通過篩選標記基因的弱化來提高表達量；方式三是通過定點整合的方式來提高表達量。
在哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，主要目的是提高產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。絕大數(shù)是在生物反應器中進行的哺乳動物單細胞培養(yǎng)都是懸浮式培養(yǎng)，具體來講就是要提高細胞密度和產(chǎn)物濃度，降低培養(yǎng)基成本與過程運行成本，同時滿足產(chǎn)品質(zhì)量要求和安全性要求。當前動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究主要集中在技術(shù)優(yōu)化方面，包括發(fā)展高通量細胞克隆技術(shù)篩選高表達細胞株，進行細胞馴化改變細胞的生長方式及生長環(huán)境，針對特定細胞的營養(yǎng)需求進行培養(yǎng)基優(yōu)化，針對特定細胞與產(chǎn)品的過程優(yōu)化等，這些都是提高細胞密度與產(chǎn)物濃度的有力途徑。以培養(yǎng)基是否添加血清成分，可以分為血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。血清的成分和作用復雜，同時存在價格昂貴、血清成分不明確、批間差異大、存在潛在污染等缺點，使培養(yǎng)過程具有不可控制性，同時血清的使用也給蛋白純化帶來困難。因此，盡管血清培養(yǎng)基適用于大多數(shù)細胞的培養(yǎng)，血清培養(yǎng)及動物來源成分培養(yǎng)已經(jīng)逐漸被FDA等藥物管理部門限制。無血清培養(yǎng)始于二十世紀六、七十年代，現(xiàn)已有各種商業(yè)化無血清培養(yǎng)基或針對特定細胞的工業(yè)用無血清培養(yǎng)基用于細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。成分明確、無動物來源成分或無蛋白培養(yǎng)基用于工業(yè)生產(chǎn)可以有效降低培養(yǎng)及下游純化成本、提高過程穩(wěn)定性、同時避免了外源生物污染，更容易被FDA等藥物監(jiān)管部門批準。而化學成分明確的培養(yǎng)基更易于對細胞的營養(yǎng)需求進行研究，使得過程優(yōu)化工作更加容易進行。因此無血清無動物來源成分或無蛋白培養(yǎng)基是大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的主要原料取向。細胞馴化的實質(zhì)是對細胞進行條件篩選的過程，其目的是通過改變細胞的生長方式和生活環(huán)境以適應特定的工業(yè)化需要。根據(jù)不同需要可以對工程細胞進行各種馴化：如貼壁的CHO細胞有懸浮生長的傾向，可以進行由貼壁生長到懸浮生長的馴化，血清培養(yǎng)的細胞經(jīng)過馴化可以無血清無蛋白培養(yǎng)，經(jīng)過馴化工程細胞可以提高對NH4+等有毒代謝物的耐受力，延長培養(yǎng)維持時間，提高產(chǎn)物濃度。動物細胞培養(yǎng)的流加工藝從二十世紀九十年代開始，日趨成熟，其目的是為了避免培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)限制和有毒副產(chǎn)品積累，使細胞生長的營養(yǎng)和理化環(huán)境盡可能長地保持穩(wěn)定，提高細胞密度和維持時間，從而提高產(chǎn)物濃度。
目前世界上大約有60%以上的重組蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)采用哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)。哺乳動物細胞制備的蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量高,它們與天然蛋白質(zhì)具有相似的理化性質(zhì)和生物學功能。隨著對基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學不斷深入研究，人們對哺乳動物宿主細胞的生理、生化有了更深入的了解。通過對生產(chǎn)藥用蛋白的哺乳動物工程細胞表達系統(tǒng)、培養(yǎng)、生產(chǎn)技術(shù)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)上進行不斷優(yōu)化,從而達到高效、安全、經(jīng)濟生產(chǎn)模式的核心生產(chǎn)技術(shù)。
第2篇：單細胞研究范文
[關(guān)鍵詞] 丹參酮ⅡA；肝癌細胞；HepG2；凋亡
[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）08-0004-03
惡性腫瘤嚴重危害著人們的健康和生命。隨著環(huán)境的惡化、人們工作生活壓力的增加，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升。惡性腫瘤的發(fā)病與細胞的增殖和凋亡異常有密切關(guān)系。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，其死亡率較高，僅次于胃癌[1]。臨床上的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療，但每種治療方法都有較大的不良反應。近年來生物療法逐漸引起臨床醫(yī)生的重視，其具有副作用小、療效高、避免正常細胞免受損傷的優(yōu)勢。丹參酮ⅡA可以增強細胞Caspase-3的活性，抑制細胞的癌基因的表達，從而誘導細胞凋亡[2]。目前國外有關(guān)丹參對肝癌HepG2細胞有抑制作用的報道屢見不鮮，但關(guān)于丹參酮ⅡA對肝癌HepG2細胞的作用的報道還比較少。本文主要是研究丹參酮ⅡA對肝癌HepG2細胞生長的抑制作用以及對其凋亡的誘導作用。現(xiàn)報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
肝癌細胞株HepG2購自上海博谷生物科技有限公司。丹參酮ⅡA由西安鴻生生物技術(shù)有限公司提供。
1.2實驗方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) （1）肝癌細胞HepG2復蘇，將細胞置入30℃～40℃水浴中迅速溶解，移至培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液到5 mL。培養(yǎng)條件37℃，5%CO2濕度飽和。每48 h換液一次，當細胞生長密度達到70%～80%時進行傳代。（2）細胞傳代：取出細胞，倒掉培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次。加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆蓋細胞，30 s后加血清的DMEM培養(yǎng)液，分裝其他培養(yǎng)瓶，并補充培養(yǎng)液。（3）將培養(yǎng)好的細胞進行凍存。取出培養(yǎng)好的細胞，倒去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次，加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆蓋細胞，30 s后加細胞凍存液，分裝至凍存管。4℃凍存10 min，-20℃凍存30 min，-70℃保存。
1.2.2 藥物處理 無水乙醇溶解丹參酮ⅡA，配成2.0 mg/mL備用。將含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液進行稀釋，共分為5個濃度：0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL；0 μg/mL為對照組。
1.3觀察指標
1.3.1 不同濃度丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制 將對數(shù)生長期的肝細胞HepG2 PBS緩沖液洗滌3次，加入0.2%的胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液配成單細胞懸液，濃度為1×105個/mL。將單細胞懸液接種于96孔板，每孔接種100 μL，培養(yǎng)24 h后換含藥的培養(yǎng)液?？瞻捉M為不含細胞只含培養(yǎng)液；陰性對照組為含0 μg/mL丹參酮ⅡA；實驗組為5個不同濃度丹參酮ⅡA。每組共重復8孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。然后棄去培養(yǎng)液，加入20 μL新鮮MTT液，培養(yǎng)4 h候棄去培養(yǎng)液。每孔加入120 μL DMSO，震蕩至結(jié)晶完全溶解，使用酶標儀在490 nm處讀取吸光度值（A），共重復3次。細胞抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。
1.3.2檢測細胞周期和凋亡情況 收集不同濃度丹參酮ⅡA處理過的細胞1×105個，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，緩慢加入70%乙醇1mL，4℃下保存過夜。取出后離心去除固定液，PBS緩沖液洗滌3次，加1.0 mg/mL的RnaseA 200 μL，37℃下水浴30 min，加PI 800 μL染色液，避光，4℃保存30 min，進行檢測。采用流式細胞儀（美國BD流式細胞儀）進行檢測，采用分析軟件計算凋亡率和各凋亡周期的比例。熒光顯微鏡下觀察細胞的凋亡形態(tài)。
1.4統(tǒng)計學方法
采用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2.1 丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制作用
相同的濃度，隨著時間延長吸光度逐漸下降，而同一時間，隨著濃度的增加吸光度也逐漸下降。見表1。相同濃度，隨著時間的延長，丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制率逐漸增加；相同時間，隨著濃度的增加，丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制率也逐漸增加。見圖1、2。
2.2細胞周期分布和凋亡率
搜集丹參酮ⅡA作用72 h的細胞，觀察細胞周期，可見隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，G0/G1的比例逐漸升高（2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL），與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。隨著丹參酮ⅡA濃度（0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL）的增加，細胞凋亡率逐漸升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。熒光顯微鏡下的細胞凋亡形態(tài)見圖3、4。
3 討論
原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，目前針對肝癌的治療方法較多，涉及到多個學科的共同協(xié)作，如能得到正確合理的治療，肝癌遠期療效還是比較理想的。目前臨床上的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等。手術(shù)治療對患者本身也是一種創(chuàng)傷，而化療和放療均對患者有較大的副作用。因此，了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，尋找效果好、副作用小的治療方法成為臨床的熱點。目前生物療法，包括免疫療法等逐漸在臨床上廣泛應用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞的異常增殖和凋亡有關(guān)。1972年Kerr等三位科學家首次提出了細胞凋亡的概念。細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等作用，它并不是病理條件下自體損傷的現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現(xiàn)象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中十分必要。凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35、CrmA、IAPs、FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。
丹參酮ⅡA為唇形科植物丹參（salvia miltiorrhza）中分離的二萜醌類化合物，臨床應用廣泛[3-6]，能夠改善冠狀動脈循環(huán)，抑制血栓疾病發(fā)生，具有顯著擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、降低心肌耗氧量、減慢心率和增加心肌收縮力的作用。丹參素及丹參酮IIA均能顯著延長小鼠耐缺氧時間，減輕缺氧引起的心肌損傷，同時，改善心肌收縮力，促進心肌再生，具有抗氧化作用，可防止LDL的氧化，從而保護EC，維持其分泌PGL2的正常功能，抗AS形成。研究報道，丹參酮對多種腫瘤細胞具有抑制和誘導凋亡的作用。吳俊偉[7]研究丹參酮ⅡA抑制人食管癌細胞的生長及機制，結(jié)果顯示其對Eca-1-9細胞的增殖具有抑制作用，丹參酮ⅡA濃度在1 μg/mL及以上濃度抑制作用明顯，并隨著濃度升高抑制作用增強。不同濃度的丹參酮ⅡA處理過Eca-1-9細胞后，抑制細胞凋亡的基因Bcl-2 mRNA的表達明顯下降。鐘志宏等[8]研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA對HepG2細胞生長的抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴性。熒光染色可以觀察典型的凋亡細胞形態(tài)特征，瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的凋亡細胞形成的梯狀條帶，作用72 h后，隨著濃度的增加細胞的凋亡率也逐漸增加。江城鋒等[9]研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA及其衍生物對Hela細胞的增殖具有抑制作用，對丹參酮ⅡA進行結(jié)構(gòu)修飾，能夠增強其抑制作用。
MTT全稱為3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，主要用于細胞增殖及細胞活性測定。1983年由Mosmann等[10]首先報道用MTT比色法測定細胞活性劑抗癌藥物對細胞增殖、活性效應。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能[11]。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜，用酶標儀在490 nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。本文采用MTT方法檢測丹參酮ⅡA對肝細胞癌HepG2的生長抑制作用。結(jié)果顯示，相同濃度隨著時間的延長，吸光度逐漸下降，而相同時間，隨著濃度的升高吸光度也逐漸下降。說明丹參酮ⅡA對肝細胞癌HepG2的生長抑制作用具有時間和濃度依賴性。0.5 μg/mL的濃度對細胞生長的抑制作用不明顯。對作用72 h的細胞檢測不同細胞周期所占比例，發(fā)現(xiàn)隨著濃度增加，G0/G1期的細胞比例逐漸增加。G0期是細胞休眠期，而G1期是從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，又稱合成前期。G0/G1期細胞的上升，S期細胞的下降提示丹參酮ⅡA抑制細胞生長的同時，也在誘導細胞向正常細胞分化。對凋亡率的檢測顯示，隨著濃度的升高，細胞的凋亡率逐漸升高，說明丹參酮ⅡA能有誘導肝細胞癌HepG2的凋亡，并且具有濃度依賴效應。
綜上所述，丹參酮ⅡA作為中藥的提取物，在臨床的應用廣泛。其對肝癌細胞HepG2的生長具有抑制作用，并且具有時間和濃度依賴性，對凋亡的誘導作用具有濃度依賴性。
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第3篇：單細胞研究范文
一、信用擔保機構(gòu)運行效率的涵義
1．效率的經(jīng)濟內(nèi)涵
不同經(jīng)濟學者對于“效率”一詞內(nèi)涵的理解并不一致，目前還沒有一個明確的含義界定。經(jīng)濟學泰斗薩繆爾森在《經(jīng)濟學》一書中，是這樣定義“效率”的：“效率意味著不存在浪費，即當經(jīng)濟在不減少一種物品生產(chǎn)的情況下，就不增加另一種物品的生產(chǎn)，它的運行便是有效率的”[1]。這時經(jīng)濟處于生產(chǎn)可能性邊界之上。國內(nèi)經(jīng)濟學者樊綱、光等在《公有制宏觀經(jīng)濟理論大綱》中給經(jīng)濟效率下的定義是“經(jīng)濟效率是指社會利用現(xiàn)有資源進行生產(chǎn)所提供的效用滿足的程度，因此也可一般地稱為資源的利用效率”[2]。它是需要的滿足程度與所耗費資源（成本）的對比關(guān)系。需要明確的是，它不是生產(chǎn)多少產(chǎn)品的簡單的物量概念，而是一個效用概念或社會福利概念。對于資源配置的效率問題，意大利經(jīng)濟學家帕累托提出了廣為人知的帕累托效率標準，得到經(jīng)濟學界廣泛的認可和應用。
最常見意義上的“效率”是指投入與產(chǎn)出或成本與收益之間的關(guān)系，也就是指現(xiàn)有生產(chǎn)資源與它們?yōu)槿祟愃峁┑男в弥g的對比關(guān)系。這里指的產(chǎn)出或收益，指的不是任意的物品，而是能夠為人們提供滿足的有用物品。從經(jīng)濟的角度看，最終的產(chǎn)出就是人們的滿足即效用。而投入或成本．從一般意義上說，是在一定的科學技術(shù)條件下生產(chǎn)一定產(chǎn)品所需的生產(chǎn)資源，包括勞動力資源和物質(zhì)資源。依據(jù)考察主體不同，效率分析具有一定的層次性。當效率概念應用于個別企業(yè)的時候，有其特定的含義，所要研究的問題主要是該企業(yè)是否利用一定的生產(chǎn)資源生產(chǎn)出了最大量的產(chǎn)出，或者是否在產(chǎn)出量一定時實現(xiàn)了成本最小。這種效率稱為技術(shù)效率。就整個社會經(jīng)濟效率而言，它要揭示的就是全部生產(chǎn)資源與所有人的總經(jīng)濟福利之間的對比關(guān)系，而在給定各生產(chǎn)單位的技術(shù)效率的前提下研究經(jīng)濟效率問題時，主要的問題在于資源是否在不同生產(chǎn)目的之間得到了合理配置，使其最大限度地滿足了最大部分人們的各種需要。用于分析這一問題的概念就是“經(jīng)濟效率”，也稱“配置效率”。
2．信用擔保機構(gòu)運行效率的涵義
對信用擔保機構(gòu)的效率問題，目前討論主要集中在信用擔保機構(gòu)的運行是否有效率上，而對于其具體的涵義還沒有一個明確的界定，更缺乏比較完整的理論體系。盡管不同的學者對信用擔保機構(gòu)的效率有不同的理解，但比較一致的看法是，信用擔保機構(gòu)的效率是信用擔保機構(gòu)在業(yè)務活動中投入與產(chǎn)出或成本與收益的對比關(guān)系。從本質(zhì)上講，信用擔保機構(gòu)的效率是指信用擔保機構(gòu)在有效地保證其資產(chǎn)安全的基礎上，能夠合理配置信用擔保機構(gòu)的資源并能最大限度地推動社會經(jīng)濟資源的流動，是信用擔保機構(gòu)市場競爭能力、投入產(chǎn)出能力和可持續(xù)發(fā)展能力的總稱。信用擔保機構(gòu)的效率可以從微觀和宏觀兩個方面加以考察。從信用擔保機構(gòu)單個部門來考察，其效率就是指各信用擔保機構(gòu)所完成的金融資源配置達到最優(yōu)狀態(tài)，也就是其投入與產(chǎn)出或成本與收益的比較。從宏觀層面來考察，信用擔保機構(gòu)效率就是信用擔保制度對國民經(jīng)濟增長的貢獻率，也就是把信用擔保機構(gòu)要素的投入與國民經(jīng)濟的增量和增長質(zhì)量進行比較。
二、信用擔保機構(gòu)運行效率的度量方法
如何度量信用擔保機構(gòu)的運行效率，不同的學者從不同角度來度量，下面介紹三種效率度量方法，即財務比率分析法、成本收益法和投入產(chǎn)出法。
1．財務比率分析法
信用擔保機構(gòu)的財務數(shù)據(jù)一般是比較容易獲取的，所以一些學者考慮用一些運行指標來度量其績效，并監(jiān)管其日常的運行。陳乃醒(2001)建立了由擔保貸款額相當于代償能力的倍數(shù)、每百元擔保貸款占用擔?；痤~、代償率、擔保貸款的經(jīng)營費用占用率、擔保貸款的總成本占用率、盈利額、破產(chǎn)臨界點、擔保基金利潤率等8個指標構(gòu)成的信用擔保的經(jīng)濟效益的評價指標體系[3]。梅保平(2004)從信用擴張、風險控制、風險分散、持續(xù)發(fā)展等方面建立了信用擔保機構(gòu)的運行能力評價指標體系[4]。放大倍數(shù)是一個重要的財務指標，放大倍數(shù)為擔保余額與擔保機構(gòu)總資本金的比例，放大倍數(shù)越高，擔?；鸬某尚Ь驮酱?，但其范圍總要控制在最大放大倍數(shù)之內(nèi)，并且受相關(guān)因素的影響。陳曉紅、謝曉光(2005)通過模型分析得出，擔保機構(gòu)對企業(yè)的調(diào)查監(jiān)控成本、反擔保控制能力和銀行對擔保機構(gòu)的監(jiān)控成本是決定擔保放大倍數(shù)的關(guān)鍵因素并由此認為互擔保在提高擔保放大倍數(shù)方面具備一定優(yōu)勢[5]。林毅(2006)以財務比率分析法為基礎，參照國內(nèi)學者任永乎、梅強(2002)等人的研究從擔保機構(gòu)的角度來衡量信用擔保體系的運行績效，分析的結(jié)果表明我國擔保機構(gòu)整體的效率比較低，其外部的社會經(jīng)濟效益也沒有充分地發(fā)揮出來[6-7]。
信用擔保計劃的成敗與違約率直接相關(guān)，但是違約率的衡量也是個權(quán)衡取舍的問題，零擔保率雖然可以確保零違約率，擔保機構(gòu)的資產(chǎn)安全性也可以得到保障，但也意味著擔保機構(gòu)的無效性和不作為。大量的實證檢驗也表明較高的違約率和較高的金融附加量是相關(guān)的，違約率應該維持在一定限度內(nèi)，超過這一限度會不可避免地導致?lián)C構(gòu)的破產(chǎn)風險。加拿大學者賴丁和海恩斯(Riding&Haines，2001)構(gòu)建了一個模型，以加拿大的SBLA（小企業(yè)貸款管理局）貸款項目為基礎從貸款銀行的期望收益角度對信用擔保機構(gòu)的違約率進行了測量[8]。
需要注意的是在應用財務比率法時要盡量避免以偏概全，要權(quán)衡各方面得失。不僅要考慮信用擔保計劃所覆蓋的范圍，又要認識到其可能面臨的風險。盡可能地發(fā)掘信用擔保更多的技術(shù)指標，以有效地衡量和監(jiān)管其日常的運行。
2．成本收益法
用成本收益法來衡量信用擔保機構(gòu)的效率，關(guān)鍵在于如何確定成本和收益，但是實踐操作中要準確地確定其成本和收益卻面臨眾多困難。一方面數(shù)據(jù)的來源是個問題；另一方面，有時即使數(shù)據(jù)準確無誤，在不同的經(jīng)濟環(huán)境下用它們來解釋信用擔保機構(gòu)的效率還是會引起很大爭議。以下是學者們衡量時常用的指標和方法。
(1)成本
信用擔保機構(gòu)的成本主要包括啟動成本、維持成本、交易成本，交易成本又包括運行成本和違約代償成本。啟動成本包括投入的資本金以及建立相應機構(gòu)、雇傭人員、對工作人員進行教育培訓和對外宣傳等相關(guān)費用。維持成本是指持續(xù)的政府補貼或外部融資來解決貸款代償后的擔?；鹑笨?。運行成本是指經(jīng)營過程中的正常運轉(zhuǎn)管理費用、學習費用和維持準備金比率的風險準備。違約代償成本是指當借款方違約時擔保機構(gòu)向金融機構(gòu)代償?shù)慕痤~。啟動成本和維持成本一般比較容易測量。學者們往往著重于衡量擔保計劃的交易成本，即運營成本和違約代償成本。例如，DavidCanuno和ClaraCradone(1999)提出了一個評估模型，較好地測量了西班牙的LGA(貸款擔保協(xié)會)的交易成本，他們的論文中就沒有過多地考慮啟動成本和維持成本而將重點放在交易成本上。
(2)收益
信用擔保計劃所帶來的收益主要集中表現(xiàn)在金融附加量上。所謂金融附加量，是指通過執(zhí)行信用擔保計劃使得目標群體從金融機構(gòu)獲得的貸款額度增加或貸款條件改善。能否產(chǎn)生金融附加量是判斷信用擔保計劃執(zhí)行收益的核心標準。如果沒有金融附加量，則信用擔保計劃就沒有收益可言。金融附加量主要包含以下幾個方面的內(nèi)容：貸款額度增加、貸款期限延長、貸款費率減少、抵押比例降低、貸款流程加快等（龔瑾瑜和韓剛，2006）[lo]。同時，信用擔保計劃的執(zhí)行還會產(chǎn)生派生收益即經(jīng)濟附加量。經(jīng)濟附加量是指由于信用擔保計劃的支持，目標群體獲得了更多的貸款額度或更有利的貸款條件，并由此使其市場機會增多，而新增加的收入額、利稅額和就業(yè)人數(shù)。經(jīng)濟附加量用來衡量信用擔保對整個經(jīng)濟的貢獻度。
Boocock和Sheriff(1996)運用了上述金融附加量指標對馬來西亞信用擔保公司的NGPS項目進行了評估，結(jié)果表明90%的借款者在沒有NFUDES擔保的情況下不能獲取正常的貸款。后來Boocock還通過調(diào)查問卷的形式進一步研究，調(diào)查的結(jié)果表明在所調(diào)查的32家企業(yè)中63%的擔保貸款是額外提供的，而不是其他金融貸款形式的替代品。加拿大學者賴丁和海恩斯(Riding＆Haines)對3000戶接受SBIA貸款的中小企業(yè)作了隨機調(diào)查，根據(jù)粗略計算，每創(chuàng)造一個就業(yè)崗位需要耗費SBLA小額貸款擔保成本不到l000加元，大額貸款擔保成本不到3000加元，平均成本約為2000加元。從成本收益來比較．SBIA貸款在創(chuàng)造就業(yè)機會上的效率極高。對于這些數(shù)據(jù)的可靠性，有些學者表示了懷疑，但是信用擔保計劃增加對目標群體的貸款量這點是毫無疑問的，只是我們需要進一步地細化其衡量的指標和方法。
3．投入產(chǎn)出法
投入產(chǎn)出法用來評價效率主要有參數(shù)法和非參數(shù)法。參數(shù)法在測度信用擔保機構(gòu)效率時，需要規(guī)定效率前沿函數(shù)的具體形式，并通過樣本信用擔保機構(gòu)估算出效率前沿函數(shù)中的各個參數(shù)。參數(shù)法大致可以分為隨機前沿法(stochasticFrontierap-proach，SFA)、自由分布法(distribu-tion-freeapproachDFA)，厚前沿分布法(thick-frontierapproachTEA)和遞歸厚前沿法(recursivethick-frontierapproachRTFA)等。這種方法有兩個缺陷：其一，函數(shù)形式需事先假定；其二，參數(shù)估計的有效性和合理性需要檢驗，參數(shù)的檢驗需要關(guān)注統(tǒng)計檢驗的有效性和經(jīng)濟含義的有效性。
非參數(shù)法對信用擔保機構(gòu)效率進行測度時，不必估算效率前沿函數(shù)中的參數(shù)及規(guī)定函數(shù)的具體形式。非參數(shù)方法主要指數(shù)據(jù)包絡分析法。數(shù)據(jù)包絡分析(dateenvelopmentanaly-sis)簡稱DEA，是數(shù)學、運籌學、數(shù)理經(jīng)濟學和管理科學的一個新的交叉領域。它摒棄了參數(shù)方法研究中的弱點，不去尋求生產(chǎn)前沿面的具體形式，而是通過所觀測的大量實際數(shù)據(jù)基于一定的生產(chǎn)有效性標準找出位于生產(chǎn)前沿面上的相對有效點。這種方法的優(yōu)點在于：①無需知道生產(chǎn)函數(shù)的具體形式，在研究中受到的約束較少；②經(jīng)濟生活是一個動態(tài)發(fā)展的過程，測度相對效率的意義將是更為深遠的。
Hway-BoonOng,MuzafarShahHabibullah,AliasRadma,M.Azali(2003)等人，運用數(shù)據(jù)包絡分析法(DEA)對馬來西亞的信貸擔保公司(CGC)的技術(shù)效率、純技術(shù)效率和規(guī)模效率進行研究。他們運用CGC的歷史面板數(shù)據(jù)，將由CGC所同意的擔保貸款作為產(chǎn)出量，將CCC的固定資產(chǎn)、經(jīng)營費用和租賃房屋費用作為投入量，他們的研究結(jié)論表明馬來西亞的信貸擔保公司總體技術(shù)效率是比較低的，因此他們建議應當考慮重新配置已有的資源、避免浪費以增加純技術(shù)效率。并且應該降低其對中小企業(yè)擔保的要求，為中小企業(yè)提供更多擔保，以提高其規(guī)模效率。
三、信用擔保機構(gòu)運行效率度置的現(xiàn)實約束
盡管國外很多學者針對信用擔保計劃的執(zhí)行效率從不同的方法和不同的角度進行了實證研究，國內(nèi)官方近年來的信用擔保發(fā)展報告也使用以上方法中的一些指標來評價我國信用擔保機構(gòu)的運行效率，但是目前為止仍然難找到令人信服的信用擔保機構(gòu)運行效率的評價報告。這主要是因為在實際經(jīng)濟運行中，對信用擔保機構(gòu)運行效率的度量遠比對其內(nèi)容和結(jié)構(gòu)的分析判斷要困難得多。主要面臨以下幾方面的約束：
1．基礎數(shù)據(jù)來源與準確性方面的約束
在世界范圈內(nèi)，從信用擔保計劃產(chǎn)生至今已經(jīng)有七八十年的歷史．國外的統(tǒng)計機構(gòu)對于信用擔保機構(gòu)的運營大都有一套完整的統(tǒng)計系統(tǒng)，這就為其運行效率的實證分析提供了基礎的數(shù)據(jù)來源。但是并不是所有的實證研究數(shù)據(jù)都能從統(tǒng)計系統(tǒng)獲?。?，成本收益法中的交易成本、金融附加量中的指標諸如貸款期限延長、貸款費率減少、抵押比例降低、貸款流程加快等。經(jīng)濟附加量指標：新增加的收入額、利稅額和就業(yè)人數(shù)即便有數(shù)據(jù)來源其準確性也因種種原因而受質(zhì)疑，例如信用擔保機構(gòu)為獲取政府補貼在上報數(shù)據(jù)時往往夸大數(shù)據(jù)或虛報數(shù)據(jù)。為了研究需要通過對借款人和貸款人進行問卷或訪談調(diào)查的辦法，但是這種主觀調(diào)查方法本身有兩個局限性：一是樣本通常較小，誤差很大；二是容易受到“霍索恩效應(HawthorneEffect)”的影響，即被調(diào)查人很可能做出他們認為調(diào)查人希望聽到的回答。
我國信用擔保機構(gòu)的發(fā)展也就十幾年的歷史，農(nóng)村信用擔保機構(gòu)的發(fā)展歷史則更短，主要是這幾年的事，很多地區(qū)對于信用擔保機構(gòu)的經(jīng)營情況不列入統(tǒng)計的范圍，基礎的數(shù)據(jù)缺乏這就在一定程度上限制了對其實證研究的展開。這也是我國學者在研究信用擔保機構(gòu)問題時理論說得多而實證研究缺乏的原因。
2．替代問題的約束
擔保貸款的規(guī)模、擔保企業(yè)個數(shù)和擔保筆數(shù)等指標，常常被引用來說明信用擔保機構(gòu)運行效果，但是由于替代問題的存在，這些指標并不能精準地度量金融附加量。信用擔保機構(gòu)運行過程中可能遇到的替代問題有兩種：一種是貸款方式替代問題；另一種是貸款機構(gòu)替代問題。
(1)貸款方式替代。這是發(fā)生在與信用擔保機構(gòu)合作的金融機構(gòu)內(nèi)部的貸款方式替代問題。合作的金融機構(gòu)并沒有增加新的貸款客戶，是從已經(jīng)建立貸款關(guān)系的客戶群體中篩選出部分客戶納入信用擔保計劃的范圍，在貸款操作上僅僅是對該部分客戶的貸款方式作一個變更，例如，從原來的抵押擔保貸款變更為信用擔保貸款，客戶群體和貸款額度都沒有因為信用擔保機構(gòu)的加入而增加。這種替代主要發(fā)生在合作的金融機構(gòu)認為信用擔保計劃并不能增加其利潤的情況下；并且合作的金融機構(gòu)為了轉(zhuǎn)移和規(guī)避信貸風險，會將原有客戶群體中風險最高的那部分轉(zhuǎn)入信用擔保計劃的范圍。
(2)貸款機構(gòu)替代。這是發(fā)生在貸款人之間的替代問題。拿農(nóng)村信用擔保來說，農(nóng)村信用擔保計劃的執(zhí)行并沒有使得某個農(nóng)村經(jīng)濟體中的農(nóng)戶和農(nóng)村中小企業(yè)獲得更多的貸款支持，而僅僅是貸款機構(gòu)的變更。貸款機構(gòu)的替代又可以分為兩種情況：一種是正規(guī)金融機構(gòu)之間的相互替代：另一種是正規(guī)金融機構(gòu)與民間金融組織之間的替代，這種替代更易發(fā)生。
3．貢獻模糊的約束
在信用擔保計劃執(zhí)行后，即使非常理想地不發(fā)生替代問題，也就是金融機構(gòu)對納入信用擔保計劃范圍的客戶所投放的擔保貸款全部是凈增貸款，信用擔保計劃收益的度量還會面臨貢獻模糊問題的約束。如前面所述，信用擔保計劃收益可用金融附加量（新增貸款額等）和經(jīng)濟附加量（新增加的收入額、利稅額和就業(yè)人數(shù)）來度量，因而本文所說的貢獻模糊是指這樣一種情況：在推行信用擔保計劃的過程中，國家宏觀經(jīng)濟、國家產(chǎn)業(yè)政策、區(qū)域經(jīng)濟政策、行業(yè)競爭狀況、金融體制改革、出口貿(mào)易機會、社會服務功能等都可能發(fā)生有利于金融機構(gòu)增加目標群體貸款的變化，這些因素都對金融機構(gòu)凈增目標群體貸款做出了貢獻，從而也為目標群體的收入額、利稅額和就業(yè)人數(shù)的增加做出了貢獻，但是各個貢獻因素的界限是模糊的，無法將信用擔保計劃的貢獻客觀地從這些綜合貢獻因素中剝離出來，這也約束了信用擔保計劃收益的準確度量?？?/p>
參考文獻(References)
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第4篇：單細胞研究范文
關(guān)鍵詞:公司對外擔保;利益衡平;交易便利
中圖分類號:f832文獻標志碼:a文章編號:1673-291x(2010)31-0088-02
概述
有限責任制度是20世紀對于經(jīng)濟發(fā)展具有劃時代意義的發(fā)明,作為有限責任制度的載體公司已經(jīng)隨著經(jīng)濟和社會的發(fā)展深入人心。公司作為市場經(jīng)濟的微觀主體,對于整個市場經(jīng)濟的發(fā)展有著重要的意義,而公司內(nèi)部責權(quán)機構(gòu)的構(gòu)建則對于整個公司治理亦是舉足輕重。
一、成文法的分析
《中華人民共和國公司法》(以下簡稱公司法)第16條共有3款,全文為:“公司向其他企業(yè)投資或者為他人提供擔保,依照公司章程的規(guī)定,由董事會或者股東會、股東大會決議;公司章程對投資或者擔保的總額及單項投資或者擔保的數(shù)額有限額規(guī)定的,不得超過規(guī)定的限額。
公司為公司股東或者實際控制人提供擔保的,必須經(jīng)股東會或者股東大會決議。前款規(guī)定的股東或者受前款規(guī)定的實際控制人支配的股東,不得參加前款規(guī)定事項的表決。該項表決由出席會議的其他股東所持表決權(quán)的過半數(shù)通過?！?/p>
第1款明確規(guī)定了公司對外提供擔保的程序要件是由公司的股東會、股東大會或董事會決議,同時如章程對于限額有規(guī)定不得超過其限額。首先,該款明確公司對外提供擔保需由法定的公司機關(guān)作出決議,即有且僅有股東會、股東大會或董事會可以作為有權(quán)機關(guān)決定公司的對外擔保,其他任何法人機關(guān)諸如法定代表人、執(zhí)行董事等均無權(quán)作出。而公司章程則有權(quán)在法定的公司機關(guān)范圍內(nèi)擇一作為擔保決議的決定機構(gòu)。同時公司章程可以對擔保限額作出規(guī)定。
第2款、第3款則規(guī)定公司對于股東或者實際控制人提供擔保,則必須通過股東會或股東大會決議,且對于決議的程序也作出了具體規(guī)定。
二、公司法第16條規(guī)定對于擔保權(quán)人的效力
依據(jù)公司法第16條所規(guī)定有關(guān)擔保的程序性規(guī)定,如果擔保權(quán)人在未滿足有關(guān)的程序性規(guī)定時,而和作為擔保人的公司的法定代表人或者高級管理人員等簽署了有關(guān)擔保協(xié)議,或者進一步加蓋了公司的公章,在此時如何判斷擔保協(xié)議之效力?
首先,公司法第16條之規(guī)定,屬于程序性的規(guī)定,但其規(guī)定為法定,其是作為國家立法機關(guān)制定并公布的法律,推定在國家范圍內(nèi)被每個主體所知悉。此法律規(guī)定區(qū)別于公司自理所確定的章程中的規(guī)定,簡單言之,法律得拘束所有主體,但公司章程依據(jù)公司法第11條之規(guī)定公司章程對公司、股東、董事、監(jiān)事、高級管理人員具有約束力。正因為此,現(xiàn)在公司法對于公司對外擔保作出了明確的規(guī)定區(qū)別于公司通過其法人自治在章程中形成的規(guī)定,所以作為擔保權(quán)人應當知悉法律對于公司擔保的限制規(guī)定。
其次,“法人之本體,則為社會的組織,故具有法律的固有之機關(guān),由此而活動……法人之機關(guān),則非自然的存在,須以法律、法人設立行為,規(guī)定其組織及權(quán)限。”[1] 公司屬于法人,
三、違反公司法第16條的法律后果
(一)認定其為效力待定
依據(jù)法理以及公司法之規(guī)定,有權(quán)對公司對外擔保作出表示意思的是依法依章程確立的有關(guān)機關(guān),其意思表示原則上應當以有關(guān)機關(guān)的決議形式作為載體。依據(jù)合同法第51條之規(guī)定,公司高級管理人員作為管理人員違反法律明確規(guī)定的擔保權(quán)限而簽訂擔保協(xié)議的顯然是一種無權(quán)處分。在這種無權(quán)處分狀態(tài)下,依據(jù)合同法以及
那么這種無權(quán)處分是否可以構(gòu)成表見而認定合同有效呢?依據(jù)表見之要件,即相對人有理由相信行為人有權(quán),而依法行使該權(quán)力的是公司法人的某個機關(guān),而非高級管理人員。此外對于權(quán)限制所生之表見需要人之相對人為善意并無過失?！绊毾鄬θ酥埔?與人就其他事項亦有權(quán)之間,有因果關(guān)系之存在……須并無過失,即雖以善良管理人之注意,而仍可信其為權(quán)限內(nèi)之行為?！盵1] 由此可以,此時并不符合表見之要件。
如果認定為效力待定,那么原則上在爭議發(fā)生時,擔保單位一般不會予以追認,由此便導致該擔保協(xié)議未生法律上之效力。但對于效力待定者,原則上沒有期限之限制,對于平衡交易便利和公司治理之間的利益未必能夠妥當。
(二)無效
直接依據(jù)合同法以及公司法之規(guī)定,而認定該協(xié)議因無公司法人相關(guān)機關(guān)的決議程序而認定其無效。
認定合同無效,是公權(quán)力對于私權(quán)的一種強制的司法干涉,其條件應當是苛刻的。公司法之規(guī)定原則上仍舊不失為一種程序性的規(guī)范,如果認定為無效,雖然從現(xiàn)行的法律規(guī)則中,擔保權(quán)人有要求擔保人承擔賠償責任之權(quán)利,但事實上對于交易便利和公司治理之間卻無法形成有效制衡。
(三)可撤銷
準用意思表示瑕疵或程序性規(guī)范之違反的撤銷制度來進行救濟,以維護利益平衡。在未撤銷前仍認定該擔保協(xié)議有效,以維護交易之便利;設立撤銷權(quán),以維護公司治理之利益,同時設定撤銷權(quán)的除斥期間,以限制公司撤銷權(quán)的濫用,并以維護交易穩(wěn)定。
總結(jié)
綜上,對于法律明確規(guī)范的公司治理中的限制,其效力應當優(yōu)先。隨著經(jīng)濟的發(fā)展,包括上市公司在內(nèi)的各種公司主體越來越多,其規(guī)模也越來越大。對于公司治理的維護應當予以肯定,但此種維護,應當亦可以考慮各種公司性質(zhì)之不同而在具體規(guī)范中體現(xiàn)出差別,進而更好地平衡公司治理所涉及之利益與涉及公司的交易便利之間的利益。 編輯整理
第5篇：單細胞研究范文
關(guān)鍵詞：中小企業(yè)；信用擔保體系；現(xiàn)狀；問題；措施
中圖分類號：F830.5 文獻標志碼：A 文章編號：1673-291X（2012）34-0081-02
引言
中小企業(yè)融資難、擔保難已是世界性難題，國內(nèi)外學者一直不斷為解決這一難題而辛苦探索，許多學者在解決中小企業(yè)融資難問題上積極建言獻策，尤其在建立中小企業(yè)信用擔保體系方面，提出了不少建設性意見和建議。2008年，顧海峰在《結(jié)構(gòu)性金融創(chuàng)新與中國中小企業(yè)信用擔保體系發(fā)展》中，重點指出了中國中小企業(yè)信用擔保體系存在的結(jié)構(gòu)性缺陷，大膽提出了以商業(yè)性擔保機構(gòu)為主導的創(chuàng)新型擔保體系。蔡文佳等人在2006年《完善中國中小企業(yè)信用擔保體系的配套機制》一文中，提出要完善信用擔保體系，就必須推進配套機制的改革，包括政府、銀行、信用擔保市場三方面的配套改革。雖然有關(guān)專家、學者已圍繞如何建立完善的信用擔保體系這一問題紛紛做了研究，但隨著中國經(jīng)濟及國際背景的變化，繼續(xù)研究這一關(guān)乎國民經(jīng)濟持續(xù)健康發(fā)展的大問題仍然具有重要的現(xiàn)實意義。
一、中小企業(yè)信用擔保體系在中國的發(fā)展狀況
中國中小企業(yè)信用擔保的實施始于1992年，自實施以來就一直受到國家及各行各業(yè)的關(guān)注。1999年6月，國家經(jīng)貿(mào)委出臺《關(guān)于建立中小企業(yè)信用擔保體系的指導意見》，從此以扶持中小企業(yè)發(fā)展為目的的信用擔保體系正式啟動。2000年8月，國務院印發(fā)《關(guān)于鼓勵和扶持中小企業(yè)發(fā)展若干政策意見》，中小企業(yè)信用擔保體系開始步入制度和體系的建設與完善階段。2003年，《中小企業(yè)促進法》生效，中小企業(yè)信用擔保的內(nèi)容再次得到發(fā)展和完善。現(xiàn)在，中國已初步形成了以政策性擔保為主、商業(yè)性和互擔保為輔的“一體兩翼”模式。但該體系仍處于初級階段，銀企、政企及擔保機構(gòu)之間尚存在許多不可調(diào)和的矛盾，因此，能否積極創(chuàng)新體制，健全中國的中小企業(yè)信用擔保體系，解決中小企業(yè)融資困境，促進中小企業(yè)進一步發(fā)展，將是未來一段時期內(nèi)我們?nèi)皂氈攸c研究的課題。
二、中國中小企業(yè)信用擔保體系的現(xiàn)存問題
1.信用擔保結(jié)構(gòu)不合理。當前國內(nèi)中小企業(yè)信用擔保體系整體存在著嚴重的結(jié)構(gòu)性金融缺陷，即由政府財政支持的政策性擔保為主，而商業(yè)擔保和中小企業(yè)之間的互助擔保比重不足，“重心偏上”現(xiàn)象嚴重。中國政府擔保額通常在60%以上，而美、日、德等國，政府擔保基本不會超過貸款總額的10%，這些國家的擔保體系不以政府為主導，而是以商業(yè)擔保為主。
企業(yè)貸款目的在于經(jīng)營和盈利，屬于經(jīng)營，而提供擔保是貸款行為的重要組成部分，因此擔保本質(zhì)上也是一種市場行為。所以，擔保產(chǎn)生的一系列問題就應由市場本身來解決，政府應作為一個宏觀調(diào)控和社會管理者的身份存在，而不是作為一個十足的市場參與者來干預經(jīng)濟。事實上，政府在充分做好宏觀調(diào)控和社會管理職能后不可能再有足夠的財力在擔保體系中起主導作用。
2.擔保資金來源單一，缺乏有效的資金補償機制。目前中國中小企業(yè)信用擔保體系仍然以政策性擔保為主，而政策性擔保機構(gòu)不以盈利為目的，只收取較低的擔保費，資金來源主要是地方政府的財政資金和資產(chǎn)劃入，金額少、規(guī)模小，由此導致政策性擔保機構(gòu)資金來源單一，缺乏資金補償機制。大多數(shù)商業(yè)擔保機構(gòu)把高額擔保費作為主要資金來源，但每年的保費收入在扣除經(jīng)營成本和稅負等費用后，能夠用來補充擔保資金的部分也非常有限，因此商業(yè)擔保機構(gòu)的資本實力也普遍較弱。由于缺乏必要的資金補充機制，擔保機構(gòu)的承保能力較弱，一旦發(fā)生代償就會面臨虧損或破產(chǎn)的風險，所以擔保機構(gòu)只能謹慎經(jīng)營，發(fā)展緩慢，從而阻礙了中小企業(yè)融資的需要。
3.擔保機構(gòu)風險防范能力較弱，缺乏風險分散機制。按國際慣例，擔保機構(gòu)對貸款的擔保比例一般應控制在70%～80%之間。但在中國，信貸管理規(guī)定百分百全額擔保，風險全部轉(zhuǎn)嫁給了擔保機構(gòu)，造成擔保機構(gòu)責任與能力不對等，弱化了銀行對企業(yè)的考察和評估，加大了整體風險。而且國家級信用再擔保機構(gòu)尚未建立，擔保機構(gòu)也不能通過再擔保方式有效轉(zhuǎn)移風險，以致其只能借助反擔保措施來降低自身風險。而中小企業(yè)融資難，原因就在于自身信用低，缺乏合格的抵押擔保品和第三方擔保人。擔保機構(gòu)的反擔保理論上雖然降低了自身風險，但實際上卻使中小企業(yè)向其申請擔保變得多余，不可能真正幫助中小企業(yè)擺脫融資困境。
4.信用體系不完善，社會化服務不健全。當前中國正處于經(jīng)濟體制轉(zhuǎn)軌時期，市場化程度不高，信用體系建設落后，失信現(xiàn)象頻發(fā)，社會信用秩序十分混亂。全國尚未形成統(tǒng)一的中小企業(yè)信用征集、登記和評估系統(tǒng)，絕大多數(shù)中小企業(yè)沒有信用記錄，信用擔保機構(gòu)無法從自身以外的任何機構(gòu)獲得關(guān)于中小企業(yè)的信用信息，從而使擔保機構(gòu)為中小企業(yè)提供貸款的風險和成本大為提升。
當前中國的金融體系也不夠完善，對中小企業(yè)的服務缺乏競爭。在發(fā)達國家，向中小企業(yè)提供貸款的一般都是民間金融機構(gòu)，它們都主動參與中小企業(yè)的融資擔保計劃，與擔保機構(gòu)主動建立長期、穩(wěn)定的合作關(guān)系，形成一種銀行對中小企業(yè)服務的良性競爭態(tài)勢。而在中國，銀行實行高度集中的管理體制，大量金融資源被大型國有商業(yè)銀行掌控，缺乏專門為中小企業(yè)服務的銀行和金融機構(gòu)。國有商業(yè)銀行盡管把持著大量金融資源，但用于對中小企業(yè)的貸款僅占其信貸總額的很小一部分。在這種沒有競爭的金融體系下，即使有擔保，中小企業(yè)也很難獲得貸款。
三、完善中國中小企業(yè)信用擔保體系的措施
1.鼓勵商業(yè)擔保和互助擔保機構(gòu)的建立和發(fā)展，優(yōu)化中小企業(yè)信用擔保體系結(jié)構(gòu)。中小企業(yè)量多面廣，需要大量的間接融資，中小企業(yè)融資擔保市場會長期處于供不應求的局面，市場前景廣闊，正適合以盈利為目的的商業(yè)擔保機構(gòu)的發(fā)展壯大。而且，商業(yè)擔保機構(gòu)可以通過再擔保、反擔保、貸款保險和多元化經(jīng)營等途徑來分散風險，從而更加具有提供信用擔保的優(yōu)勢。為此，國家應重點擴大和發(fā)展商業(yè)性擔保機構(gòu)，提高其在擔保市場中的比重，逐步使其占據(jù)主導地位。
鼓勵中小企業(yè)互助擔保機構(gòu)的建立和發(fā)展，發(fā)揮民間資本的基礎作用。通過多個中小企業(yè)共同出資的方式組建互擔保機構(gòu)，用互助擔保機構(gòu)的資金和信譽為成員企業(yè)提供融資擔保。互助擔保機構(gòu)作為一個利益集團，能夠在與協(xié)作銀行的談判中發(fā)揮優(yōu)勢作用，為中小企業(yè)爭取更多的利益。
政府擔保機構(gòu)應本著市場化運作的原則，盡量避免行政干預。政策性擔保機構(gòu)應將資金委托給專業(yè)機構(gòu)擔保，從而有效防止政府直接干預，而且還可以充分利用專業(yè)人員，發(fā)揮政府擔保機構(gòu)的機能。而且，政府擔保應對受擔保對象規(guī)定一定的標準，實行動態(tài)擔保。當受擔保企業(yè)獲得貸款并發(fā)展到一定規(guī)模后，就不應再是政府擔保的對象。要努力建立政府擔保同民間擔保相互分工、合作與補充的信用擔保體系。
2.實現(xiàn)擔保資金供給多元化，建立有效的資金補償機制。信用擔保資金須堅持多元募集。其中，政府可將信用擔保資金納入財政預算中，每年劃撥一定資金作為擔?；穑目萍及l(fā)展基金、技改貸款貼息中劃出一定金額作為高科技行業(yè)的風險補償，也可以將中小企業(yè)稅收收入的一定比例專門用于擔保機構(gòu)的資金補償，還可以通過發(fā)行專項國債來補償中小企業(yè)擔保資金。各類擔保機構(gòu)要建立風險準備金制度，根據(jù)業(yè)務量，每年從保費和利息收入中提取一定比例作為補充，形成風險補償基金，彌補擔保機構(gòu)的風險損失。
國家財力有限，信用擔保不可能完全依賴財政資金，所以，政府應放寬政策，積極鼓勵信用擔保資金多元化，如以員工持股方式募集、社會公眾募集、股份聯(lián)合、金融機構(gòu)捐助及鼓勵國內(nèi)外捐贈資金投入等。另外，適當引進外資也是解決擔保資金約束問題的一大途徑，如目前唯一被“泛美擔保協(xié)會”納入會員的中國經(jīng)濟技術(shù)投資擔保公司就已具備了引進外資的條件。
3.完善風險分散機制，提高擔保機構(gòu)風險防范能力。鼓勵貸款銀行與擔保機構(gòu)建立風險共擔機制，使擔保機構(gòu)與銀行之間按約定比例共同分擔風險。對被擔保方，擔保機構(gòu)可以運用反擔保來分散風險，或運用不同的擔保費率和承保比例相結(jié)合的方式來鎖定自身風險。
允許和鼓勵保險公司介入，按照合理負擔原則，為擔保機構(gòu)或擔?；鹛峁╋L險保險。在此基礎上構(gòu)建與之相適應的再擔保制度，設立專門的再擔保機構(gòu)，為貸款擔?；鸹驌９咎峁┰贀！Ｕ畵；鹨部梢杂兄攸c地為民間擔保機構(gòu)提供再擔保，在發(fā)揮政府資金引導作用的同時，從根本上提高其風險防范能力。
4.加快中小企業(yè)信用體系建設，營造良好的社會信用環(huán)境。各級政府相關(guān)部門應加大對中小企業(yè)的管理力度，加強立法，制定嚴格的失信懲戒制度，從法律和制度上約束失信行為，形成企業(yè)和全社會的信用約束機制，提高社會誠信水平。同時，中小企業(yè)要強化自身信用意識，倡導企業(yè)信用文化，規(guī)范財務制度，提高財務信息透明度，積極建立與金融機構(gòu)的信息互換機制，以便銀行進行科學、準確的資信調(diào)查，提高企業(yè)的資信等級。此外，還需建立一個強大完整的中小企業(yè)信用評級系統(tǒng)，組織信用評級機構(gòu)開展對中小企業(yè)的信用評級工作，實現(xiàn)信用信息共享。
總之，中小企業(yè)信用擔保體系的建立和完善是一個長期、復雜的系統(tǒng)工程，政府、金融機構(gòu)、擔保機構(gòu)和企業(yè)都要努力參與其中，緩解中小企業(yè)的融資困境，共同推動中小企業(yè)的發(fā)展壯大，從而增強中小企業(yè)的國際競爭力。
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第6篇：單細胞研究范文
關(guān)鍵詞：氧化低密度脂蛋白；THP-1細胞；細胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激
中圖分類號：R329.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349（2011）08-0973-03
近年來,細胞凋亡在動脈粥樣硬化的形成和進展中的作用日漸成為研究熱點,斑塊破裂伴血栓形成是造成動脈粥樣硬化臨床急性癥狀的主要原因,而大量的細胞凋亡直接造成斑塊不穩(wěn)定［1］。巨噬細胞通過對斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量、炎癥反應、纖維成分的降解及新血管形成等方面來影響動脈粥樣硬化病變的進展,在動脈粥樣硬化形成的所有階段都起著極其重要的作用［2］。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是動脈粥樣硬化重要的危險因素,ox-LDL被巨噬細胞大量吞噬后會導致巨噬細胞胞漿內(nèi)大量膽固醇的聚集并進一步形成泡沫細胞，同時會導致血循環(huán)中的單核細胞向內(nèi)皮表面黏附并不斷向內(nèi)皮下趨化,并在內(nèi)皮下分化成常駐的巨噬細胞［3］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的細胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損傷引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），通過激活未折疊蛋白質(zhì)反應（UPR）以保護由ERS所引起的細胞損傷，長期過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激便會誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細胞凋亡［4］。不同于經(jīng)典的凋亡途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應性凋亡途徑是一種最近提出的新的凋亡途徑，研究其發(fā)生機制可為動脈粥樣硬化等相關(guān)疾病的預防和治療提供新的方向。本研究主要探討ox-LDL對人單核巨噬細胞（THP-1）凋亡的影響及其引起凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗儀器 CO2孵箱（HERA cell 150）,倒置顯微鏡（Nikon TS100，日本）,超凈工作臺（LONGHONG，中國）,恒溫水浴箱（HS-4，成都儀器廠）,低溫臺式離心機（Labofuge 400R，Heraeus），F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）。
1.1.2 實驗試劑 人 THP-1單核細胞購自中科院上海細胞庫。ox-LDL由北京醫(yī)科大附屬醫(yī)院實驗室饋贈。RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國）,10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）,胰蛋白酶（solarbio,Spain），PMA（Sigma,美國），鼠抗人GRP78、Caspase-12、CHOP一抗及羊抗鼠IgG二抗均購自Santa Cruz美國公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養(yǎng)與誘導 將人THP-1單核細胞懸浮于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，在5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在光學顯微鏡下可見細胞呈球形，懸浮狀態(tài)。視細胞生長情況進行傳代、換液，選擇生長良好的第3代～第5代細胞用于實驗。實驗前在培養(yǎng)液中加入終濃度為100 mmol/L的PMA孵育48 h，誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞。在光學顯微鏡下可見細胞轉(zhuǎn)化為貼壁狀態(tài)，并伸出偽足，呈現(xiàn)巨噬細胞形態(tài)。
1.2.2 實驗分組 對照組:細胞置1640培養(yǎng)基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。ox-LDL組:在細胞培養(yǎng)瓶中分別加入ox-LDL（25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL）在1640培養(yǎng)基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在細胞的培養(yǎng)瓶中加入ox-LDL 75 μg/mL在1640培養(yǎng)基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。
1.2.3 細胞凋亡的檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙標記染色法進行檢測，分組分孔收集細胞（1×106個），1 000 r/min離心5 min，棄上清液，每管用200 μL PBS重懸成單細胞懸液。加入10L Annexin V-FITC和5L PI，加入300L Binding Buffer輕輕混勻，避光室溫反應15 min，流式細胞儀檢測，以凋亡的巨噬細胞占巨噬細胞總數(shù)的百分比為凋亡率。
1.2.4 Western blot測GRP78、Caspase-12、CHOP的表達 分組分孔收集細胞（1×106個）,進行免疫印跡法（Western Blot）檢測GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達。將每管細胞洗滌,離心,用細胞裂解液裂解細胞,在其中加入等體積的樣品緩沖液混勻，沸水煮沸5 min，使蛋白質(zhì)變性，將蛋白質(zhì)分裝并凍存于-70 ℃冰箱中保存。取樣品蛋白質(zhì)100 μg,用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉，依次加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h后，ECL發(fā)光液孵育5 min后，置于圖像分析系統(tǒng)進行圖像掃描及強度分析。
1.2.5 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多重比較采用LSD法，P
2 結(jié) 果
2.1 ox-LDL對THP-1細胞凋亡的影響 各組細胞經(jīng)流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組細胞生長良好， ox-LDL處理的細胞則出現(xiàn)凋亡細胞。與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P
表1 不同濃度ox-LDL作用THP-1細胞
48 h后凋亡情況（x±s）%
表2 75 μg/mL ox-LDL作用于THP-1細胞
凋亡情況（x±s）%
2.2 各組細胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達 常規(guī)培養(yǎng)的對照組無GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白的表達，用50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL濃度的ox-LDL培養(yǎng)細胞48 h后 GRP78、CHOP、Caspase-12表達均增加。詳見圖 1。
注：1為對照組，2為50μg/mL組，3為100μg/mL組，4為200 μg/mL組。
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圖1 各組細胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達
3 討 論
細胞凋亡是動脈粥樣硬化病變的主要特征之一,其中巨噬細胞凋亡貫穿動脈粥樣硬化的整個過程。巨噬細胞泡沫化及其最終凋亡的過程中泡沫細胞聚集壞死形成脂核并使其不斷增大,導致臨件發(fā)生［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊和鈣離子存儲的主要場所，對多種生理功能的完成具有重要意義。然而，細胞內(nèi)外環(huán)境的改變導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)氧化環(huán)境被破壞，鈣代謝紊亂，突變的蛋白質(zhì)產(chǎn)生或蛋白質(zhì)的二硫鍵不能形成，大量異常的蛋白質(zhì)聚集在細胞內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)失衡，這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂狀態(tài)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激［6］。 GRP78被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑，也被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志，但是過強或時間過長的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能會導致細胞死亡［7］。Caspase-12 激活是觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)凋亡途徑的重要信號轉(zhuǎn)導通路。Caspase-12 以酶原形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞漿側(cè),在ERS 時被特異激活而誘導細胞凋亡［8］。CHOP也是觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)凋亡途徑的重要信號轉(zhuǎn)導通路。CHOP 又稱生長停滯及DNA 損傷基因（Growth Arrestand DNA Damage Induciblegene 153,GADD 153）,存在于細胞漿內(nèi),在ERS 時被活化轉(zhuǎn)位至細胞核,通過下調(diào)Bcl-2 表達而促進細胞凋亡。 本實驗以不同濃度的ox-LDL與THP-1細胞共同培養(yǎng)不同時間,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL以時間和濃度依賴的方式誘導THP-1細胞的凋亡。ox-LDL濃度為100 μg/mL作用48 h最明顯。隨著時間的延長和濃度增加THP-1細胞凋亡呈遞增后遞減變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激啟動的凋亡途徑是近年才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑，用ox-LDL培養(yǎng)人THP-1細胞并檢測Caspase12、CHOP、GRP78蛋白的變化來探討ox-LDL是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑誘導細胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 μg/mL 的ox-LDL作用于細胞48 h后,GRP78、Caspase-12、CHOP的表達都明顯增加,提示ox-LDL可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引發(fā)細胞凋亡。 不同于線粒體介導的凋亡途徑，ERS引起的細胞凋亡有一套自身的信號傳遞通路，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡（ER-associated death，ERAD）途徑，而且參與ERS 的分子伴侶和感受蛋白是ERS 特異誘導的，因此能夠作為治療相關(guān)疾病的有效靶點。
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作者簡介：張峰娟（1981―），女，醫(yī)師，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學2008級研究生（郵編：030001）；邊云飛，工作于山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院；劉金帥，工作于潞安集團總醫(yī)院。
第7篇：單細胞研究范文
【關(guān)鍵詞】 天花粉蛋白；，，HeLa細胞；，，細胞凋亡
摘要：目的研究天花粉蛋白(TCS)對人宮頸癌HeLa細胞生長的抑制作用， 探討TCS抗腫瘤的作用機制。方法采用MTT法檢測TCS對Hela細胞的抑制作用，形態(tài)學觀察、DNA電泳及流式細胞儀檢測TCS對HeLa細胞的誘導凋亡作用。結(jié)果TCS對HeLa細胞的生長具有明顯的抑制作用，顯微鏡下可見細胞圓縮，胞漿凝聚等凋亡細胞的形態(tài)學改變，DNA凝膠電泳呈梯級格局，流式檢測出現(xiàn)凋亡峰，凋亡比例具有劑量和時間依賴性。結(jié)論 天花粉蛋白通過誘導細胞發(fā)生凋亡而抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖。
關(guān)鍵詞：天花粉蛋白； HeLa細胞； 細胞凋亡
Experimental Study of Trichosanthin's Effect on Hela Cells Proliferation
Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effect of trichosanthin(Tcs) on Hela cells and its anti-tumor mechanism.MethodsThe antiproliferative effect of TCS on Hela cells was measured with MTT assay. Light microscopy was used to observe the morphology changes ， DNA agarose electrophoresis and FCM analysis were carried out to examine the induced apoptosis.ResultsThe proliferation of HeLa cells was significantly inhibited by TCS， Hela cells showed a serial of characteristic changes of apoptosis such as cell volume shrinkage ， chromatin condensation; the occurrence of DNA ladder and apoptosis rate of Hela cells was dose and time dependent. Conclusion Trichosanthin can inhibit the proliferation of Hela cells by its induction of apoptosis.
Key words： Trichosanthin; Hela cell; Proliferation
宮頸癌是導致婦女死亡的第二大原因，嚴重威脅女性身體健康。天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）是從葫蘆科植物栝樓（Trichosanthin kirilouii Maxim）的塊根中提取出來的一種單鏈核糖體失活蛋白(ribosome - inactivating protein ， RIP)，具有多種生物學效應，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等作用［1］ 。目前，TCS的抗腫瘤研究主要集中在絨毛膜上皮癌、胃腸道腫瘤和白血病等方面［2～3］。本實驗研究TCS對人宮頸癌HeLa細胞生長的抑制作用，并從誘導細胞凋亡的角度探討其抗癌作用，為藥物的進一步研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試劑 MEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國GIBCOBRL公司，碘化丙啶（Propidium Iodide ，PI）及RNase A (RNA酶)為Simga公司產(chǎn)品，噻唑藍(MTT)購自Amresco公司。二甲基亞砜(DMSO)購自Fluka公司，TCS購自上海金山制藥廠（純品，規(guī)格為1.2 mg/ml）。
1.2 細胞培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細胞為本室傳代保存，培養(yǎng)于5%CO2，37℃濕化孵箱中。培養(yǎng)基MEM含10%FBS，0.1 U/L青霉素，0.1 U/L鏈霉素，取對數(shù)生長期細胞待用。
1.3 細胞生長抑制實驗采用噻唑藍(MTT)還原法進行檢測:將Hela細胞接種于 96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)(每孔的細胞數(shù)為2×104個)，細胞貼壁后對照組換新鮮培養(yǎng)基，實驗組換用含有不同濃度TCS的培養(yǎng)基，置 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng) 24 ，48，72 h ，去上清，加入 MTT 溶液200 μl/孔，置 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 4 h，去上清，每孔加入200 μl DMSO ，輕度振蕩后，測定 570 nm 處光吸收值。取8孔吸收值平均數(shù)，按公式細胞抑制率(%)=(1-實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%計算藥物對細胞生長的抑制作用。
1.4 細胞凋亡的檢測
1.4.1 細胞形態(tài)學觀察 將處于指數(shù)生長期的Hela細胞以不同濃度的TCS處理后，倒置顯微鏡下觀察Hela細胞的形態(tài)改變。
1.4.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳 胰蛋白酶消化收獲實驗組及對照細胞， 1 000 r/min離心5 min，PBS清洗細胞兩遍， NP40溶液作用細胞沉淀，加入SDS(終濃度1%)及RNase(終濃度2 μg/μl)，56℃處理2 h，蛋白酶K(終濃度2 μg/μl)37℃作用3～5 h， 加入1/10體積的3M醋酸鈉及2倍體積的無水乙醇，輕輕振搖后置于-70℃冰箱中過夜， 14 000 r/min離心15 min，棄上清，用冰冷的 70％乙醇漂洗，1.2% 瓊脂糖凝膠30 V電泳3～5 h，紫外觀察拍照。
1.4.3 流式細胞儀檢測分別離心收集對照組及實驗組細胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定， 在10 000 r/min條件下離心5 min，去乙醇，PBS洗滌兩次，棄上清；用0.5 ml PBS重懸，加入等體積的細胞裂解緩沖液室溫作用5
min，加Rnase A (終濃度30 μg/ml)置37℃水浴中消化30 min，離心后再加人1m1 PI染色(終濃度50 μg/ml)避光染色30 min，以300目尼龍網(wǎng)濾過，上流式細胞儀檢測， Multicycles 軟件分析結(jié)果。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用 SPSS 10.0 for windows統(tǒng)計軟件包作ANOV方差分析。
2 結(jié)果
2.1 MTT法測定結(jié)果20，40和80 μg/ml的天花粉蛋白分別作用于Hela細胞后，隨著作用時間的延長，細胞的生長抑制率逐漸升高，且抑制率隨藥物濃度增加而上升， 呈一定的劑量、時效依賴性。結(jié)果見圖1。
圖1 TCS對Hela細胞作用的時間-劑量曲線（略）
2.2 Hela細胞的形態(tài)學改變 鏡下可見(×200)對照組Hela細胞始終為多角形，梭形，貼壁牢固， TCS處理的Hela細胞逐漸變圓， 細胞體積縮小，胞漿凝縮， 折光率增強， 呈現(xiàn)凋亡細胞的形態(tài)改變。結(jié)果見圖2。
圖2 Hela 細胞形態(tài)改變（略）
2.3 DNA凝膠電泳圖譜 凝膠電泳分析經(jīng)不同濃度的TCS（20，40和80 μg/ml）處理48 h的Hela細胞DNA斷裂成相差約200 bp的片段，呈現(xiàn)凋亡細胞的梯級（ladder）格局，而對照組細胞DNA無斷裂現(xiàn)象。結(jié)果見圖3。
圖3 凋亡細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳（略）
2.4 細胞凋亡的檢測 凋亡細胞在流式細胞儀直方圖上可出現(xiàn)特征性的亞二倍體峰（sub―G1 peak）。由表1可見， 隨著天花粉蛋白藥物濃度的增大及作用時間的延長，凋亡細胞的比例增加，表明TCS誘導Hela細胞凋亡具有時間和劑量依賴性。
表1 凋亡細胞在各組標本中所占的百分比時間（略）
3 討論
細胞凋亡是細胞生長、發(fā)育過程中發(fā)生的一種復雜的生理過程。Dunne等［4］發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與細胞凋亡的調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)。有資料表明，許多抗癌藥物都是通過最終觸發(fā)腫瘤細胞凋亡而達到治療的目的，有效的誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的新的手段之一［5］。天花粉蛋白(TCS)是一種有效并具有專一性的抗腫瘤藥物，與一般化療藥物造成的腫瘤細胞和正常細胞兩敗俱傷的作用不同，它對人的外周血淋巴細胞、T細胞和羊膜細胞等正常體細胞影響極?。?］，具有顯著優(yōu)勢。天花粉蛋白是Ⅰ型單鏈核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein ， RIP)，能進入細胞內(nèi)直接使核糖體失活。TCS能夠使絨毛癌細胞發(fā)生凋亡，其誘導凋亡的作用與胞內(nèi)的Ca2+濃度升高和活性氧基團(reactiveoxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生有關(guān)［7～8］。本實驗將天花粉蛋白處理HeLa細胞后，HeLa細胞的生長受到明顯抑制，出現(xiàn)凋亡的特征性改變：染色體凝聚、核碎裂等形態(tài)改變，凝膠電泳呈現(xiàn)典型的梯級（ladder）格局，流式結(jié)果可見特征性的亞二倍體峰，且凋亡細胞的比例隨藥物濃度的增高及作用時間的延長而增高。這些結(jié)果表明TCS對Hela細胞具有良好的抑制作用和明顯的誘導凋亡效應，并具有濃度和時間依賴性，初步顯示了良好的藥物開發(fā)前景。對其抗癌機理進行深入研究，有望應用于宮頸癌等腫瘤的臨床治療。
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第8篇：單細胞研究范文
關(guān)鍵詞 樹突狀細胞 流式細胞術(shù) 混合淋巴細胞反應
AbstractObjective:To induce and culture purity dendritic cells（DCs） of different maturation phase from human peripheral blood monocytes in vitro.Methods:The peripheral blood mononuclear cells were isolated from human peripheral blood with density gradient centrifugation.The first step was to work on a 7-day culture of monocytes in medium supplement with 100ng/ml rhGM-CSF and 5ng/ml rhIL-4,and the cells were actually immature.In the second step,the cells were cultured in the medium supplement with GM-CSF and TNF-α,and cultured until the 14th day.Mature DCs were obtained.Cells harvested were identified for their morphology by microscope,properties of DCs detected by FCM,function with MLR method.Results:Immature dendritic cells expressed CD1a molecules and costimulating molecules in middle level,HLA-DR in high level.In maturation phase DCs expressed costimulating molecules,HLA-DR molecules,CD83,and CD11c highly.These DCs could stimulate proliferation of allogenic T lymphocytes.Conclusion:The method to obtain DCs of different maturation phases from human peripheral blood monocytes is successfully set up.A number of DCs with high purity are obtained.
KeyWordsdendritic cells;flow cytometry;mixed lymphocyte reaction（MLR）
樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是溝通天然免疫和獲得性免疫的橋梁，對于免疫反應的啟動、進展以及免疫耐受的誘導至關(guān)重要［1，2］。很多學者應用體外大量擴增DCs，然后用腫瘤抗原沖擊后回輸患者治療腫瘤，取得一定效果［3］。然而外周血中的含量也僅占單個核細胞總量的0.5%～1.0%，難以分離和純化。本研究采用細胞因子（GM-CSF、IL-4、TNF-α）聯(lián)合培養(yǎng)，在促成熟期不再加入IL-4的方法，獲得成熟DCs。
資料與方法
一般資料：外周血：健康男性成人獻血者，晨起空腹抽取肘靜脈血。
主要試劑：重組人白細胞介素4（rh IL-4，Peprotech公司）；重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF，廈門特寶生物公司）；CD1α-FITC、CD80-FITC等單克隆抗體（BD公司）；DMSO（Sigma公司）。
方法：①DC的誘導培養(yǎng)：在離心管內(nèi)加入體積比為1:1.5的淋巴細胞分離液和肝素化的新鮮稀釋血液，離心25分鐘，吸取界面層單個核細胞，用生理鹽水洗滌2次，棄上清獲得人外周血單個核細胞。將獲得的單個核細胞用含10%自體血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基將所得細胞重懸，混勻，調(diào)整細胞濃度為（2～3）×106個/ml，以1ml/孔加入24孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育6小時后，吸棄培養(yǎng)上清，祛除非貼壁細胞，即可獲得貼壁的DC前體細胞。將獲得的貼壁細胞用每孔加入含rhGM-CSF（100ng/ml）和rhIL-4（5ng/ml）的RPMI1640完全培養(yǎng)基1ml，隔天半量換液，A組培養(yǎng)至7天收集細胞，B組培養(yǎng)至7天換培養(yǎng)液即含rhGM-CSF（100ng/ml）和TNF-α（10ng/ml）的RPMI1640完全培養(yǎng)基1ml，隔天半量換液，培養(yǎng)至14天收集成熟DC細胞。培養(yǎng)期間用倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)變化和細胞生長趨勢。②DCs表面相關(guān)表型的檢測：將不同時期的DCs用PBS調(diào)至106/ml，加入離心管，每管20μl/106個細胞，加FITC標記的CD80、CD86、CD1a和PE標記的CD83、HLA-DR及APC標記的CD11c單抗，4℃冰箱避光孵育30～60分鐘，PBS洗滌，用600μl PBS重懸細胞待測。③混合淋巴細胞反應：效應細胞制備，取異體的健康人外周靜脈血，經(jīng)上述方法獲得PBMC，貼壁法獲得非貼壁細胞，即為同種異體淋巴細胞。刺激細胞制備，培養(yǎng)7天和14天的DCs組，按刺激細胞:應答細胞（DCs:同種異體淋巴細胞）1:10、1:100及1:1000的比例加入96孔培養(yǎng)板，各100μl，每個樣品設3個復孔，混合培養(yǎng)4天后，1000r/分，離心5分鐘，棄去上清120μl，每孔加入5g/L的MTT 20μl，37℃、5% CO2條件下孵育4小時，1000r/分，離心5分鐘，棄去全部上清，每孔加入DMSO 100μl，微型振蕩10分鐘，酶標儀490nm處測各孔吸光度（A）值，結(jié)果以3個復孔的均值表示。
統(tǒng)計學方法：使用SPSS統(tǒng)計學軟件進行方差分析，以X±S表示。
結(jié) 果
DCs形態(tài)學觀察：PBMC經(jīng)2小時貼壁后，有部分細胞懸浮，多為B淋巴細胞和外周血DCs；當加入GM-CSF、IL-4過夜培養(yǎng)后，貼壁細胞數(shù)量較少，體積??；誘導2天，貼壁細胞伸展，呈高度多形性；培養(yǎng)5天，細胞形態(tài)不規(guī)則，粗細不等的毛刺多而密，呈現(xiàn)典型的DCs形態(tài)；第7天時正常組DC表面突起更加明顯；當加入TNF-α后，成簇現(xiàn)象明顯增多，并且大量突起交織；但隨著時間的延長，梭形細胞減少，個別細胞開始增大變圓，在培養(yǎng)14天，幾乎所有DCs均逐漸增大變圓，出現(xiàn)懸浮趨勢。對于在7天之后未加TNF-α的A組細胞未出現(xiàn)B組細胞的成熟現(xiàn)象。結(jié)果見圖1、2。
圖1 第7天
流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志結(jié)果：按DCs常規(guī)培養(yǎng)7天后，再次檢測DCs的特異標記，達到成熟水平；誘導14天后，DCs的成熟標記的表達量均高于7天組的表達量（P＜0.05），而DCs的CD1a標記的表達量兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。
混合淋巴細胞反應：7天組的DCs由于沒有完全成熟，促進T細胞增殖的作用不明顯，但經(jīng)過促成熟因子TNF-α刺激后的DCs，達到完全成熟后，DCs明顯促進同種淋巴細胞增殖（P＜0.05），并且隨著DCs濃度的下降增殖效果減弱。見表2。
討 論
本實驗利用其外周血取材簡單方便的優(yōu)點，從中獲得PBMC，在反復實驗的過程中發(fā)現(xiàn)單核細胞屬于貼壁細胞，然而在隔天換液的時候仍有較多的懸浮細胞，這些懸浮的細胞大多是B淋巴細胞，因此經(jīng)長時間的貼壁培養(yǎng)加上在換液時將懸浮細胞祛除，便得到較多的純度較高的單個核細胞分化而來的DCs。經(jīng)過GM-CSF、IL-4聯(lián)合誘導后，可以從每100ml外周血中獲得9×106個未成熟的樹突狀細胞。由于IL-4在誘導過程中主要抑制培養(yǎng)體系中中性粒細胞和巨噬細胞生長，并維持DCs的未成熟狀態(tài)。因此，在培養(yǎng)7天后本實驗就用GM-CSF和TNF-α聯(lián)合在誘導7天至其成熟，這樣既節(jié)省了培養(yǎng)成本，又能獲得成熟的DCs。
本實驗結(jié)果表明人外周血誘導獲得的DCs在形態(tài)學上完全符合不成熟、成熟的典型形態(tài)即樹突樣的突起以及后期變大變圓；表面分子的表達情況，在未成熟期時，DCs中度表達CD1a、CD80、CD86、CD83、CD11c、及HLA-DR；經(jīng)過TNF-α誘導后，DCs成熟后，高表達CD80、CD86、CD83、HLA-DR及CD11c，對于樹突狀細胞表面表達的CD1a分子，在培養(yǎng)體系中加入TNF-α前后，期表達量變化不明顯，可與其他表面分子共同作為區(qū)分未成熟DCs與成熟DCs表面標志物；通過混合淋巴細胞反應進一步驗證了未成熟DCs只有較弱的激活T細胞的能力，經(jīng)TNF-α誘導后變?yōu)槌墒霥Cs就具有了強大的激活初始型T細胞的能力。
DCs的來源成為很多研究的瓶頸，本實驗從簡單方便的外周血中用細胞因子誘導出大量功能性的成熟DCs，為研究DCs的作用以及臨床應用奠定了基礎。
圖2 第14天
參考文獻
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第9篇：單細胞研究范文
【關(guān)鍵詞】 缺血再灌注；凋亡；丹參；中藥；綜述
在肝、腎、腦等器官缺血再灌注損傷(Ischimia reperfusion injury,IRI)造成的細胞死亡形式中，凋亡也是一種常見而重要的形式[1-4]。組織細胞一旦壞死，目前人們尚無辦法干預；但細胞凋亡是受一系列程序控制的過程，人們有可能通過干預死亡程序加以挽救。丹參經(jīng)現(xiàn)代實驗技術(shù)證實，對IRI時細胞過度凋亡有抑制作用，本文就此方面的內(nèi)容予以綜述。
1 丹參對IRI時細胞凋亡的抑制作用
Wu.W等[5]利用原位細胞凋亡標記(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated uridine nucleotide end labeling,TUNEL)實驗觀察到：左大腦中動脈結(jié)扎后24 h大鼠大腦皮層、尾狀核、豆狀核缺血區(qū)出現(xiàn)大量凋亡細胞，24~48 h達到高峰；預先給予丹參則在相應部位只見到少量凋亡細胞；且與對照組比較，24 h時間段組織損傷明顯減輕。提示丹參可能通過減少神經(jīng)細胞凋亡對腦IRI發(fā)揮保護作用。丹參是否對其他器官也有類似作用目前尚未明了。
2 丹參抑制IRI時細胞凋亡的作用機制
2．1 減少蛋白酶表達
細胞發(fā)生凋亡的中心環(huán)節(jié)是激活以蛋白酶-白介素-1轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1β-converting enzyme,ICE)組成的級聯(lián)反應。ICE可在天冬氨酸殘基之后將33KD的IL-1前體裂解為17．5KD的IL-1β，屬于ICE蛋白酶超家族。
目前已發(fā)現(xiàn)13個成員，根據(jù)其序列同源性分為3個亞家族：ICE-樣、ICE-1樣和CPP32樣蛋白酶。它們具有保守的底物結(jié)合和酶促序列，在天冬氨酸后將底物降解，故該酶現(xiàn)被稱為半胱天冬蛋白酶(cysteine apartate-specific proteinase,caspase)，并把上述三個亞家族分別稱為caspase-1、caspase-2和caspase-3亞家族。它們的過度表達將導致細胞凋亡的發(fā)生[6]。
張金濤等[7]利用S-P免疫組化法發(fā)現(xiàn)，前腦IRI后1 d，大鼠海馬CA1、CA4區(qū)出現(xiàn)明顯的ICE免疫陽性反應，第3天達高峰，第5天后明顯減少；腦皮質(zhì)也呈現(xiàn)出與海馬區(qū)類似的現(xiàn)象，ICE免疫陽性反應細胞散在分布。與此相反，丹參組ICE的表達明顯減少，特別是大腦皮層區(qū)和海馬CA1區(qū)。因此，作者認為ICE在腦缺血中可能發(fā)揮重要的凋亡調(diào)節(jié)作用；丹參能下調(diào)腦缺血區(qū)ICE表達，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。
2．2 阻斷誘導細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導
大多數(shù)情況下，來自于細胞外的誘導因素，如自由基、細菌、病毒等作用于細胞后轉(zhuǎn)化為細胞凋亡信號，并通過胞內(nèi)不同的信號轉(zhuǎn)導途徑最終激活細胞死亡程序，導致細胞凋亡。因此，凋亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)是連接凋亡誘導因素與核DN段化斷裂及細胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)[6]。丹參經(jīng)實驗證實，可干預下列已知的凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路，從而實現(xiàn)其抗凋亡作用。
2．2．1 死亡因子及其受體介導的信號轉(zhuǎn)導
腫瘤壞死因子(TNF)家族中的TNF、Fas 配體、TNF-相關(guān)凋亡誘導性配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL或 Apo2L)和Apo3L能誘導細胞凋亡，因此被稱為死亡因子[6]。介導它們誘導凋亡的受體為死亡受體。在體內(nèi)，TNF主要由巨噬細胞(Mφ)分泌。大量體內(nèi)外實驗證明，丹參不僅可有效抑制Mφ分泌TNF-α，還可以在基因水平抑制TNF-α在肝、腎、心等組織中的蛋白表達[8,9,10,18]。所以，丹參可能通過抑制TNF-α的生成和釋放，減少IRI時細胞凋亡。但其具體受體后途徑是抑制NF-κB還是JNF/AP-1則目前尚無文獻報道。
2．2．2 第二信使鈣誘導的凋亡
Ca2+是細胞凋亡發(fā)生過程中重要的信息分子。［Ca2+］i持續(xù)升高可使核酸內(nèi)切酶激活，DN段化。應用膜聯(lián)蛋白熒光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)雙標記及流式細胞術(shù)、全細胞膜片鉗放大系統(tǒng)顯微熒光測定術(shù)同步觀察H2O2誘導人類肝細胞(LO2細胞)、內(nèi)皮細胞(EVC304)凋亡時不同時限Ca2+流變化和丹參提取物Rxa的影響時發(fā)現(xiàn)：①H2O2作用后0．5 h即出現(xiàn)Ca2+躍升現(xiàn)象；當［Ca2+］i>400 nmol/L后1 h出現(xiàn)典型的細胞凋亡膜翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，即磷脂酰絲氨酸從細胞膜內(nèi)層轉(zhuǎn)移到外層；此后，［Ca2+］i持續(xù)升高，早期凋亡細胞(Annexia-V+)、死亡細胞(PI+)指數(shù)均上升；熒光顯微鏡下出現(xiàn)大量綠色熒光的早期凋亡細胞和胞漿或胞核紅染的死亡細胞。同時［Ca2+］i上升了一個數(shù)量級；②在Rax處理組H2O2作用8 h后［Ca2+］i尚未超過400 nmol/L，與對照組比較差異顯著(P400 nmol/L很可能是細胞凋亡啟動的早期信號。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運，由此可能減少其在核內(nèi)促進凋亡基因信號傳遞中的作用及其后引起的細胞凋亡，減輕細胞損傷。分析其機理可能是：①作為咖啡?？s酚酸衍生物之一的Rax富含酚羥基，可和H2O2發(fā)生氧化反應，接受O-生成羧基-COOH，從而直接減輕H2O2對細胞膜及細胞器膜的損傷，減少Ca2+經(jīng)細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滲漏入細胞內(nèi)；②因肝細胞Ca2+內(nèi)流由鈣-鈣調(diào)蛋白復合物和IP3敏感鈣池共同調(diào)節(jié)。故Rax對LO2極顯著的Ca2+阻滯作用可能是直接作用于鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白受體，阻止受體操縱性鈣通道開放所致[11]。
2．2．3 由線粒體損傷后啟動的細胞凋亡 新近的研究證實，由活性氧(ROS)、細胞內(nèi)Ca2+超載或缺血缺氧等病理因素也是誘發(fā)細胞凋亡的重要觸發(fā)機制[11,12]。當這些死亡信號到達線粒體后，首先引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)換并釋放凋亡相關(guān)蛋白，包括細胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后參與激活凋亡激活因子與caspase-9的結(jié)合及caspase-9的激活，后者繼而激活caspase-3，從而導致細胞凋亡。IRI時ROS生成過多，細胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體受損，誘導細胞過度凋亡[6]。丹參具有強大的清除自由基、減輕鈣超載、保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整等作用，因而可切斷上述誘導因素的產(chǎn)生，阻斷了此通路啟動的細胞凋亡[13-15,17]。
2．3 調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達
細胞凋亡是級聯(lián)式基因表達的結(jié)果。目前已知細胞凋亡相關(guān)基因多達數(shù)十種，根據(jù)功能不同分為三類：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl-2，其中對Bcl-2的研究最為詳細而系統(tǒng)；促進凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；雙向調(diào)控基因，如J-myc、Bcl k等。正常情況下，促進凋亡基因與抑制凋亡基因處于協(xié)調(diào)的對立統(tǒng)一狀態(tài)，IRI時這種平衡被打破，組織細胞凋亡增多[2]。
張金濤等[7]報道BcL-2在前腦缺血2 h就有表達，于6 h達高峰，其后減少。此變化以海馬CA1區(qū)最為顯著。說明BcI-2主要在細胞凋亡早期發(fā)揮作用。丹參在缺血30 min給予后，BcL-2的表達明顯增加。趙明中等[15]采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫組化法進一步證實復方丹參滴丸不僅可以使BcL-2蛋白的陽性表達數(shù)(PEI)明顯增加，還可使心肌細胞凋亡指數(shù)及Fas蛋白PEI下降。且隨著復方丹參滴丸的劑量加大而進一步降低(P
綜上所述，丹參作用廣泛，對IRI細胞凋亡各環(huán)節(jié)都有調(diào)節(jié)作用，從細胞、分子及基因水平阻斷了IRI發(fā)生發(fā)展過程中因細胞凋亡引起的一系列“惡性循環(huán)”，從而表現(xiàn)出對IRI顯著的保護作用。因此，丹參對減輕IRI來說是一種十分理想的藥物，在臨床上具有廣闊的應用前景；同時丹參的抗凋亡作用也為臨床上治療因凋亡過度引起的疾病提供了一條新思路。
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