稻曲毒素含量與致病力關(guān)系探析

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本文作者：尹小樂(lè)，陳志誼，劉永鋒，于俊杰，李燕，俞咪娜 單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

材料與方法

粗毒素的提取。刮取1g新鮮稻曲球外層的厚垣孢子粉末，分別用水﹑甲醇和丙酮各80mL振蕩60min提取。超聲30min，雙層濾紙過(guò)濾，將濾液真空旋轉(zhuǎn)濃縮獲得的漿狀物即為粗毒素。每種提取方法各重復(fù)3次。

粗毒素的生物活性測(cè)定。9cm滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)襯雙層滅菌濾紙，用7mL毒素液（按1.1中所得粗毒素漿狀物用水稀釋定容至25mL）浸濕濾紙，對(duì)照加清水；小麥種子（揚(yáng)麥158）用次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒90s，無(wú)菌水沖洗后置于培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿20粒，28℃培養(yǎng)4d，酌情保濕，每皿調(diào)查15粒麥粒根長(zhǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。胚根伸長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照胚根平均長(zhǎng)度-處理胚根平均長(zhǎng)度）/對(duì)照胚根平均長(zhǎng)度]×100%。

粗毒素的組分分析。HPLC檢測(cè)粗毒素用水稀釋經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后通過(guò)高效液相色譜儀Agilent1200進(jìn)行分析。檢測(cè)器為可變紫外波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD）；色譜柱為EclipseXDB-C18（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相為水-甲醇-甲酸（400﹕70﹕1，V/V）；流動(dòng)相流速為0.8mL•min-1；柱溫為40℃；樣品進(jìn)樣量為20μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。1.3.2質(zhì)譜分析將粗毒素用水稀釋經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后通過(guò)ESI源的Agilent6410三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。質(zhì)譜條件：ESI源（+）；氣體溫度350℃；氣體流速10L•min-1，霧化器壓力45psi；毛細(xì)管電壓（capillaryvoltage）4000V；碎裂電壓：135.0V；175.0V；200.0V；掃描范圍m/z100—800。

稻曲毒素A檢測(cè)方法。對(duì)全國(guó)5個(gè)稻區(qū)的224份稻曲球樣品進(jìn)行毒素A含量檢測(cè)。刮取每份稻曲球樣品的厚垣孢子，充分混勻后稱(chēng)取其中0.1g粉末作為待測(cè)樣品，按照1.1的方法用水提取稻曲毒素A，按照1.3.1的方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)。因?yàn)闆](méi)有稻曲毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，以1份采集自南京的稻曲球粉末作為參照樣品，連續(xù)檢測(cè)5次取平均峰面積M。每檢測(cè)5份樣品的同時(shí)就檢測(cè)參照樣品，在參照樣品峰面積穩(wěn)定（M±10%之內(nèi)認(rèn)定為穩(wěn)定）的前提下檢測(cè)數(shù)據(jù)認(rèn)定有效，所以比較每份樣品的峰面積就能夠相對(duì)比較出樣品真實(shí)含量的相對(duì)高低。

稻曲菌致病能力測(cè)定方法。田間試驗(yàn)于2010年和2011年在江蘇省農(nóng)科院溧水基地試驗(yàn)田中進(jìn)行。按照張君成等[15]方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的52株稻曲菌進(jìn)行致病力測(cè)定。挑取已單孢純化的稻曲病菌株轉(zhuǎn)接到PSA培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)15d。取菌株生長(zhǎng)邊緣處用直徑為3.5mm的打孔器打孔，取12個(gè)菌絲塊放入裝有20mLPS培養(yǎng)液的50mL離心管中，在28℃、130r/min下振蕩培養(yǎng)，7d后將含有孢子和菌絲的混合液接種。用注射器注射，每穗1mL，每個(gè)菌株接種10穗，接種后做上標(biāo)記。在收割前15d調(diào)查接種結(jié)果，每株稻曲菌調(diào)查8穗的稻曲球數(shù)及病穗數(shù)，進(jìn)行病害發(fā)生程度的分級(jí)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考唐春生等[16]方法。病指計(jì)算方法：病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病穗數(shù)×相應(yīng)的級(jí)數(shù)）（/調(diào)查總穗數(shù)×最大病級(jí)數(shù)）×100。1.6稻曲菌產(chǎn)毒素A量與致病力相關(guān)性分析采集每株稻曲菌致病產(chǎn)生的所有稻曲球刮取厚垣孢子，充分混勻后稱(chēng)取其中0.1g粉末作為待測(cè)樣品，按照1.4進(jìn)行檢測(cè)。用SPSS17.0分析軟件畫(huà)出菌株產(chǎn)毒素A量與其致病力的散點(diǎn)圖，計(jì)算其相關(guān)系數(shù)，并根據(jù)相關(guān)系數(shù)大小分析相關(guān)程度：R＜0負(fù)相關(guān)；R=0無(wú)線性相關(guān)；|R|＞0.95顯著性相關(guān)；|R|＞0.8高度相關(guān)；0.5≤|R|＜0.8中度相關(guān)；0.3≤|R|＜0.5低度相關(guān)；|R|＜0.3關(guān)系極弱，認(rèn)為不相關(guān)。顯著性概率P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

不同提取方法所得稻曲菌粗毒素的生物活性。分別用純水、甲醇和丙酮3種極性不同的溶劑提取，獲得的粗毒素對(duì)小麥胚根生長(zhǎng)的抑制程度不一。其中，純水和甲醇提取所得粗毒素對(duì)小麥胚根伸長(zhǎng)的抑制活性較強(qiáng)，抑制率分別達(dá)59.6%和52.9%，二者無(wú)顯著差異；丙酮提取所得粗毒素處理與CK無(wú)顯著差異。

稻曲菌粗毒素及其主要活性組分分析。將3種提取方法所得粗毒素用純水稀釋?zhuān)^(guò)0.45m微孔濾膜后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，并對(duì)每個(gè)色譜峰用VWD進(jìn)行了紫外掃描。比較水-甲醇-甲酸、水-甲醇-乙酸和水-甲醇-磷酸作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)磷酸的色譜峰型最好，甲酸次之，乙酸最差?？紤]到后續(xù)的樣品純化工作需要盡量保持分析型HPLC和制備型HPLC工作條件的一致，本研究采用水-甲醇-甲酸流動(dòng)相系統(tǒng)。同時(shí)比較了不同體積比的水-甲醇的分離效果，測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相中水-甲醇體積比為400﹕70時(shí)，各種組分分離效果和重現(xiàn)性最好（圖1）。甲醇和水提取獲得的粗毒素色譜圖中疑似稻曲毒素A的11.394min組分（圖略）和11.385min組分（圖1，組分ii）峰面積相當(dāng)，但水提取的峰形較好且前期雜質(zhì)較少。丙酮幾乎沒(méi)有提取出疑似組分。色譜圖結(jié)果與生物毒性試驗(yàn)結(jié)果一致。分別對(duì)甲醇和水提取獲得的疑似組分進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)掃描結(jié)果幾乎完全一致：均有3個(gè)吸收峰，分別在207、254、290nm（水提取紫外掃描圖見(jiàn)圖2，甲醇提取圖略），與已報(bào)道文獻(xiàn)中稻曲毒素A的紫外特征吸收相吻合[5,9]。因?yàn)榈厩蚝裨咦又泻写罅恐苄缘纳仉s質(zhì)，但用純水提取又會(huì)出現(xiàn)厚垣孢子粉末漂浮在提取液面之上不能充分浸入液體的問(wèn)題，所以在后續(xù)的研究中采用純水中加少量甲醇的方法提取稻曲毒素A。將粗毒素用純水稀釋后過(guò)0.22m微孔濾膜后進(jìn)行LC-MS分析，總離子流圖見(jiàn)圖3，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。6.073min組分（Ⅰ）的ESIm/e為645.9（M+H）+、11.444min組分（Ⅱ）的ESIm/e為673.9（M+H）+、14.058min組分（Ⅲ）的ESIm/e為558.9（M+H）+、15.362min組分（Ⅳ）的ESIm/e為494.9（M+H）+，分別與國(guó)外已發(fā)表文獻(xiàn)中的稻曲毒素B（M+H，646）、A（M+H，674）、C（M+H，559）、D（M+H，495）的相對(duì)分子質(zhì)量基本一致[5]。由于質(zhì)譜圖（圖3）中峰II的保留時(shí)間與高效液相色譜圖（圖1）中峰ii的保留時(shí)間極為接近，再結(jié)合紫外吸收光譜（圖2），初步證明高效液相色譜圖中的組分ii為稻曲毒素A。

不同地區(qū)稻曲球毒素A相對(duì)含量的比較及不同。地區(qū)稻曲菌產(chǎn)稻曲毒素A量與致病力相關(guān)性分析從全國(guó)5個(gè)稻區(qū)采集224份稻曲球樣品，用HPLC檢測(cè)樣品中的毒素A的相對(duì)含量。檢測(cè)結(jié)果（表1）表明，不同地區(qū)稻曲球的平均含量差異較大；其中四川地區(qū)的平均稻曲毒素A含量最高（995），是平均含量最低的江西（535）的1.86倍。不同地區(qū)的高含量樣品所占比重差異也很大，在采集自四川的29份樣品中有15份高含量樣品，占51.7%；在采集自江西的21份樣品中只有2份高含量樣品，占9.52%。測(cè)定了來(lái)自全國(guó)7個(gè)省份52個(gè)稻曲菌菌株在感病品種兩優(yōu)培九上的產(chǎn)生致病反應(yīng)和產(chǎn)毒素A量，結(jié)果表明（表2），52個(gè)稻曲菌菌株的致病性分化十分顯著（病情指數(shù)7.5—100），產(chǎn)毒素A量也差異顯著（最高產(chǎn)量是最低產(chǎn)量的2.7倍）。運(yùn)用SPSS17.0分析軟件，做出52個(gè)菌株產(chǎn)稻曲毒素A量和致病力（病情指數(shù)）的二維散點(diǎn)圖（圖5），其相關(guān)系數(shù)R=0.222，顯著性概率P=0.114，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析結(jié)果表明，稻曲菌菌株的產(chǎn)毒素A量與致病力相關(guān)性不顯著。

討論

植物病原毒素是植物病原菌產(chǎn)生的對(duì)寄主植物有毒性的代謝產(chǎn)物，在病原菌侵染致病定殖過(guò)程中常起到重要作用，是導(dǎo)致植物病害發(fā)生的主要因素之一?？嫡裆萚17]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)禾谷鐮刀菌菌絲尚在寄主體表擴(kuò)展而未侵入寄主細(xì)胞時(shí)，病菌已產(chǎn)生分泌脫氧鐮刀菌烯醇毒素DON，隨著寄主組織中DON濃度的升高，寄主細(xì)胞相應(yīng)發(fā)生了一系列病理變化，寄主細(xì)胞壞死后病菌進(jìn)入壞死的寄主細(xì)胞定殖。在病原菌毒素應(yīng)用方面，目前已有多種病原菌毒素被應(yīng)用于抗病品種篩選或抗病突變體篩選抗性評(píng)價(jià)[18-19]，而稻曲毒素在稻曲菌致病過(guò)程中所起作用尚未清楚，同時(shí)常規(guī)方法在稻曲病抗性評(píng)價(jià)上存在一定的局限性，已成為制約高抗病品種選育的主要因素之一。對(duì)稻曲毒素進(jìn)行深入分析可為深入闡明稻曲菌的致病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，為稻曲病抗病育種提供新的途徑。

本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)稻曲菌培養(yǎng)液中存在抑制小麥胚根生長(zhǎng)的活性成分，但無(wú)論是用有機(jī)溶劑還是用水浸提都無(wú)法在高效液相上檢測(cè)出稻曲毒素A，筆者轉(zhuǎn)而從稻曲球中尋找毒素A，在提取溶劑的選擇上發(fā)現(xiàn)水和甲醇都可以獲得毒素A。本研究采用水中加少量甲醇的方法提取粗毒素，并用LC-MS對(duì)粗毒素中多種活性成分進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)共有4種組分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），分別與國(guó)外已發(fā)表文獻(xiàn)中的稻曲毒素B（M+H,646、A（M+H，674）、C（M+H，559）、D（M+H，495）的相對(duì)分子質(zhì)量一致。由于質(zhì)譜圖中組分II的保留時(shí)間（11.444min）與HPLC色譜圖中組分ⅱ的保留時(shí)間（11.385min）極為接近，再結(jié)合紫外吸收光譜（圖2），初步證明高效液相檢測(cè)出了稻曲粗毒素中的毒素A。

研究病原菌不同菌株產(chǎn)毒素A量與致病性分化之間的相關(guān)性對(duì)進(jìn)一步明確病原菌的致病機(jī)理具有重要的參考價(jià)值。俞剛等[20]發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌的產(chǎn)毒能力與其致病力成正相關(guān)，不產(chǎn)毒的突變菌株對(duì)小麥等寄主的致病力顯著低于野生型菌株，雖能定殖寄主，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，且不能造成典型病斑，更不能在寄主組織中擴(kuò)展。桑茜等[21]發(fā)現(xiàn)不同黃萎病菌分離物分泌的粗蛋白含量存在明顯差異，與其所致的病情指數(shù)呈顯著正相關(guān)，且黃萎病菌強(qiáng)致病力分離物分泌的粗毒素對(duì)棉苗的致萎力較強(qiáng)，弱致病力分離物分泌的粗毒素對(duì)棉苗的致萎力較弱。本研究用人工接種的方法，測(cè)定了52個(gè)稻曲菌株對(duì)感病品種兩優(yōu)培九的致病力，并采集每株稻曲菌致病產(chǎn)生的所有稻曲球，用HPLC檢測(cè)等重量稻曲球粉末中稻曲毒素A含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2）52株稻曲菌在兩優(yōu)培九上致病力分化和產(chǎn)毒素A量均差異顯著，但是不同稻曲菌株的產(chǎn)毒素A量與致病力相關(guān)性不顯著。由于采集稻曲球時(shí)病害已獲得充分?jǐn)U展，稻曲球中的毒素A含量的高低可能受到其它多種因素的影響，與致病力相關(guān)性很低。因此，深入研究接種稻曲菌后水稻植株內(nèi)稻曲毒素A的動(dòng)態(tài)消長(zhǎng)與致病力的相關(guān)性或許更能說(shuō)明到毒素A在病程中所起作用。另外，稻曲菌屬于營(yíng)養(yǎng)爭(zhēng)奪型病菌，致病力越強(qiáng)的稻曲菌病粒率越高，單個(gè)稻曲球獲得的營(yíng)養(yǎng)就較少[16,22]，這對(duì)稻曲毒素A含量是否產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。