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豬流感病毒檢測ELISA檢測技術(shù)應(yīng)用

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豬流感病毒檢測ELISA檢測技術(shù)應(yīng)用

摘要:生豬養(yǎng)殖過程中,豬流感疾病是危害生豬養(yǎng)殖健康狀況和生產(chǎn)性能的常見疾病,給生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的科學(xué)發(fā)展帶來了巨大的阻礙。豬流感是由豬流感病毒所導(dǎo)致的一種傳染性強(qiáng)、傳播迅速、較難根治的一種呼吸道疾病?,F(xiàn)階段通過酶聯(lián)免疫吸附檢測試驗(yàn)(elisa)可以快速有效地了解豬流感的發(fā)病和流行情況,并進(jìn)行科學(xué)的診斷和治療。ELISA檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)以及試驗(yàn)操作相對簡單的優(yōu)勢,給生豬疾病檢疫人員帶來了很大的便利。本文對ELISA檢測技術(shù)及其在豬流感病毒檢測上的應(yīng)用進(jìn)行介紹,旨在為科學(xué)推廣ELISA檢測技術(shù)以及生豬的健康養(yǎng)殖帶來幫助。

關(guān)鍵詞:ELISA檢測技術(shù);豬流感;病毒檢測;應(yīng)用措施;健康養(yǎng)殖

豬流感是由流感病毒所引起的,在生豬養(yǎng)殖過程中一種常見的急性、傳染性呼吸道疾病,對于生豬養(yǎng)殖的健康水平以及生產(chǎn)性能均有非常大的負(fù)面影響。自從本世紀(jì)初的甲型H1N1流感在畜牧養(yǎng)殖中大肆蔓延之后,對于流感病毒的檢測方法開始逐漸受到人們的重視?,F(xiàn)階段主要的流感病毒檢測方法有血清學(xué)診斷方法、分子生物學(xué)檢測方法、量子點(diǎn)生物探針流式免疫技術(shù)以及液相芯片技術(shù)等,其中血清學(xué)檢測方法中的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)是當(dāng)前流感病毒檢測中最常用的方法之一,ELISA檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)以及試驗(yàn)操作相對簡單的優(yōu)勢,給生豬疾病診斷帶來了很大的便利。

1ELISA檢測技術(shù)的基本原理

ELISA檢測技術(shù)早在上世紀(jì)70年代開始應(yīng)用,主要是通過抗原定位酶標(biāo)抗體的方式進(jìn)行應(yīng)用,成為一種測定液體中微量物質(zhì)的新技術(shù)。ELISA檢測技術(shù)的原理主要是通過具有免疫活性的抗原或者抗體通過包被在固態(tài)的某種載體上,通過將包被的載體與相應(yīng)的樣品相結(jié)合形成一種具有免疫活性或酶活性的酶標(biāo)抗原或者抗體物質(zhì),再將其與這些具有酶活性的酶標(biāo)抗原或者抗體物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)后形成結(jié)合的復(fù)合物,通過下一步的洗滌去除雜質(zhì)后,通過添加底物以及酶形成呈色反應(yīng),通過酶標(biāo)儀定量或者定性分析,從而進(jìn)行樣品中物質(zhì)的檢測[1]。

2ELISA檢測技術(shù)的分類

ELISA檢測技術(shù)按照不同的檢測目的以及方法進(jìn)行不同的分類,ELISA檢測技術(shù)可以用于檢測抗原或者抗體,以及固相的抗原或者抗體免疫吸附劑、酶標(biāo)記的抗原或者抗體結(jié)合物等。不同的ELISA檢測技術(shù)中酶反應(yīng)底物是所必須的試劑,通過根據(jù)ELISA檢測技術(shù)中試劑之間的結(jié)合方式進(jìn)行了不同的分類,主要的ELISA檢測技術(shù)分類有ELISA直接檢測法、ELISA間接檢測法、ELISA雙抗夾心檢測法、ELISA捕獲檢測法、ELISA競爭檢測法等[2]。

3ELISA檢測技術(shù)在豬流感病毒檢測中的應(yīng)用

ELISA在豬流感病毒檢測中的應(yīng)用主要是通過依靠豬流感病毒純化蛋白作為檢測抗原或者抗體,血凝素(HA)作為豬流感病毒主要的表面抗原,是由HA1蛋白和HA2蛋白所組成,其中HA1是高度進(jìn)化的抗原或者抗體的結(jié)合區(qū)域,而HA2相對而言較為保守,核蛋白NP同HA2蛋白相同也較為保守。在豬流感病毒檢測的ELISA檢測技術(shù)中通常有ELISA間接檢測法、雙抗體夾心ELISA檢測法、捕獲法抗原ELISA檢測等。

3.1ELISA間接檢測法

ELISA間接檢測法主要是通過利用酶標(biāo)記的抗體來檢測與固相載體上抗原所結(jié)合的待測抗體的檢測方式,ELISA間接檢測的方法不但可以有效檢測出豬流感病毒機(jī)體抗體水平,還可以準(zhǔn)確的區(qū)分豬流感疫苗免疫抗體和各種豬流感亞型野毒感染所產(chǎn)生的機(jī)體抗體?,F(xiàn)階段通過利用H1亞型豬流感病毒的HA1純化蛋白作為識別抗原,建立了科學(xué)有效的豬流感病毒ELISA間接檢測技術(shù),通過檢測血清中的豬流感病毒抗體的陽性符合率可以達(dá)到85%~95%左右,通過利用H3亞型的流感病毒中的HA和HA1蛋白,將其純化后使用單克隆抗體作為包被的抗原建立了ELISA間接檢測的方法,對于血清中豬流感病毒的檢出率達(dá)到86%~93%左右[3]。有研究學(xué)者通過使用H5亞型的豬流感病毒,以HA1重組蛋白為基礎(chǔ)建立ELISA間接檢測的方法,在患病動物血清中豬流感病毒準(zhǔn)確檢出率達(dá)到94%左右。通過利用H1、H3以及H9的亞型豬流感病毒建立基于M2蛋白多肽抗原的間接ELISA檢測方法,發(fā)現(xiàn)可以有效檢測出血清中多種流感病毒亞型的抗體,準(zhǔn)確率可以達(dá)到98%以上。間接ELISA檢測方法的優(yōu)點(diǎn)在于與包被抗原反應(yīng)的抗體是不加酶的抗體,該抗體有效保留較高的免疫活性,通過酶標(biāo)記的另一個二抗抗體可以有效的加強(qiáng)信號傳導(dǎo),間接ELISA檢測方法的缺點(diǎn)在于出現(xiàn)交叉反應(yīng)的可能性比較高[4]。

3.2雙抗夾心ELISA檢測方法

雙抗夾心ELISA檢測方法是通過將已知的抗體吸附到固相載體上后,將待測的抗原與吸附于固相載體的抗體結(jié)合后再與酶標(biāo)記的二抗相結(jié)合的方法,這種檢測方式適用于具有至少雙表位的抗原。研究學(xué)者通過使用H1亞型的豬流感病毒中HA單克隆抗體,初步建立的豬流感病毒的雙抗夾心ELISA檢測方法,檢測血清樣本中陽性樣本的符合率達(dá)到96%左右。通過利用H9亞型流感病毒的高免血清中的IgG作為包被抗體,再使用抗AIV-NP-7B4單克隆抗體作為雙抗夾心ELISA檢測方法的二抗,成功建立了豬流感病毒抗原的雙抗夾心ELISA檢測方法,可以準(zhǔn)確迅速的檢出患病動物血清中H9亞型豬流感致病性病毒。雙抗夾心ELISA檢測方法的優(yōu)點(diǎn)在于高度的靈敏性和專一性,同時抗原檢測過程不需要純化,雙抗夾心ELISA檢測方法的缺點(diǎn)是此方法不適用于小分子半抗原的病毒檢測,同時待檢測的抗原需要擁有至少兩個以上的抗體結(jié)合部位[5]。

4結(jié)束語

ELISA檢測技術(shù)具有高度的靈敏性以及較強(qiáng)的特異性,同時具有操作方法簡便、經(jīng)濟(jì)成本相對較低、檢測造成的污染較小以及所需儀器設(shè)備常見、便宜等優(yōu)勢,該項(xiàng)檢測技術(shù)缺點(diǎn)有抗原制備純度,抗體制備的含量和純度要求較高、較復(fù)雜和困難。另外ELISA技術(shù)應(yīng)用于單克隆抗體的篩選、活性的測定以及制備純化是大海撈針的工作量,也是制約ELISA檢測技術(shù)發(fā)展的一個重要瓶頸。未來將通過其他高端技術(shù),精密儀器在ELISA技術(shù)中的發(fā)展和應(yīng)用,將不斷提升ELISA技術(shù)在動物疫病和人類疾病監(jiān)測和診斷中的應(yīng)用,將會是未來檢測中不可取代的一項(xiàng)重要技術(shù)和手段。

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[4]王元凱,王君,王雨晨,等.玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及間接競爭ELISA檢測方法的建立[J].微生物學(xué)通報,2011,38(12):1793-1800.

[5]姬希文,閆麗萍,顏丕熙,等.鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2011,33(8):630-634.

作者:郝衛(wèi)芳 單位:山西省太原市動物預(yù)防控制中心