黃芪的作用精選(九篇)

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第1篇：黃芪的作用范文

1、補(bǔ)氣益血，健脾養(yǎng)胃，增強(qiáng)體質(zhì)，提高免疫，抗病毒。很適合流感季節(jié)飲用。

2、黃芪可補(bǔ)氣健脾、益肺止汗，民間常用于治療產(chǎn)后乳汁缺少，又可補(bǔ)虛固表，治療產(chǎn)后虛汗癥。母雞性味甘溫，能溫中健脾、補(bǔ)益氣血。

3、此湯適用產(chǎn)后體虛、面色萎黃、乳汁過少、易出虛汗等癥。需要注意的是，黃芪燉雞湯宜在產(chǎn)后5～7天后食用。

（來源：文章屋網(wǎng) ）

第2篇：黃芪的作用范文

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)；1007－2349(2007)06－0030－02

黃芪為豆科植物莢膜黃芪和內(nèi)蒙黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，益氣固表，托毒生肌，利水消腫等功效。化學(xué)成分包括含黃芪多糖、多種氨基酸、黃芪皂苷、維生素及硒、硅、鈷、鉬等微量元素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)它具有調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)細(xì)胞代謝、強(qiáng)心、利尿、降壓、降血糖等作用。本文就黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制及其在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用做一概述。

1　黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用

1．1黃芪對(duì)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)作用 黃芪能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，使血白細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著升高。

1．2黃芪對(duì)T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)作用黃芪注射液可明顯增加腫瘤的T細(xì)胞總數(shù)(TLC)與輔助細(xì)胞數(shù)(Th)，同時(shí)外周血a－醋酸奈酯酶細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)增加。體內(nèi)注射可促進(jìn)Con．A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化。體外實(shí)驗(yàn)表明，低濃度黃芪可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而高濃度黃芪反而使之活力受抑制，說明黃芪具有免疫增強(qiáng)和免疫抑制的雙向調(diào)節(jié)作用。黃芪對(duì)受胰酶損傷的T細(xì)胞E受體有明顯修復(fù)作用，能使損傷，脫落的E受體重新復(fù)原。

1．3黃芪對(duì)B淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)作用電鏡觀察，黃芪皂苷能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖與分化。研究還發(fā)現(xiàn)，黃芪能減輕鉆60照射對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的破壞。

1．4黃芪對(duì)IL－2產(chǎn)生有促進(jìn)作用IL－2主要由輔T細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性細(xì)胞因子，作用已活化的T細(xì)胞促進(jìn)增殖并對(duì)B細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用。黃芪可明顯促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的水平，間接增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。

1．5黃芪能提高病毒誘生和自生干擾素的能力，促進(jìn)免疫分子生成黃芪不僅能促進(jìn)環(huán)已亞胺、放射菌素D在人肺二倍體細(xì)胞上引起IFN―P超誘導(dǎo)反應(yīng)，而且可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ。

1．6黃芪能促進(jìn)抗體和補(bǔ)體生成 黃芪水煎劑中的黃芪多糖能使脾臟的漿細(xì)胞增殖，促進(jìn)抗體合成。電鏡觀察黃芪皂苷甲能促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化和漿細(xì)胞抗體生成，不僅漿細(xì)胞數(shù)量增多，而且胞質(zhì)內(nèi)擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中也有大量的抗體成分。黃芪水提液可明顯升高肝炎患者的總補(bǔ)體(CHso)和分補(bǔ)體(C3)。

2　黃芪免疫調(diào)節(jié)作用在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

2．1用于防治感冒 黃芪能提高病毒誘生和自生干擾素的能力，增強(qiáng)對(duì)病毒抑制作用，促進(jìn)抗體生成。易感者在感冒流行季節(jié)服用黃芪，不僅可使感冒次數(shù)減少，而且使感冒癥狀較輕，病程較短。

第3篇：黃芪的作用范文

20世紀(jì)60年代后,斯坦福大學(xué)與美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所從臨床病例分析發(fā)現(xiàn)放射線確能引起心臟損傷[1]。由此確定了放射誘發(fā)心臟病(radiation induced heart disease)這一名詞。由于放療對(duì)腫瘤治療的廣泛應(yīng)用,對(duì)人體正常部位的輻射損傷日趨被人們所重視,目前尚無(wú)特效防治方法。筆者針對(duì)放射損傷機(jī)理,采用黃芪治療取得較好的結(jié)果,現(xiàn)結(jié)果如下。

1  資料與方法

1.1  一般資料

    選擇湘雅醫(yī)院、湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬二醫(yī)院1999年10月－2006年11月期間接受胸部放射治療的腫瘤患者,在治療前后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)的臨床資料分析,共65例。其中男35例,女30例；年齡22～72歲,中位年齡61歲；肺癌33例,食道癌27例,胸腺癌1例,縱隔腫瘤2例,乳腺癌2例。觀察對(duì)象一般情況較好,能耐受運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)。其中治療組33例,對(duì)照組32例,2組年齡、性別、原發(fā)病均無(wú)顯著差異(p>0.05),具有可比性。

1.2  納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

    符合放射性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn),并排除對(duì)st段指標(biāo)的影響因素,合并陳舊性心肌梗死、心瓣膜病變、預(yù)激綜合征、束支阻滯、心肌病、貧血和電解質(zhì)紊亂等不列入觀察范圍。

    放射源及劑量：采用60 coγ射線或直線加速器x射線照射,常規(guī)劑量分割,心臟及其相連大血管受照體積50%以上。照射總劑量40～70 gy/4～8周。

1.3  治療方法

   

對(duì)照組采用臥床休息,給予輔酶q10膠囊(上海旭東海普藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字19993852,每粒10 mg)20 mg,每日3次；肌苷片(上海天晴制藥廠,國(guó)藥準(zhǔn)字h33020003,每片0.2 g)0.4 g,每日3次口服。并給予胰島素12 u、維生素c注射液5.0 g、10%氯化鉀注射液10 ml、加入10%葡萄糖注射液500 ml中靜脈滴注,每日1次。心力衰竭、心律失常者給予強(qiáng)心劑和抗心律失常藥。重癥者加用糖皮質(zhì)激素。治療組在上述治療的基礎(chǔ)上加用黃芪120 g,水煎服,每日2次。2組療程均為4周。

1.4  觀察指標(biāo)

   

治療前均記錄臨床癥狀、體征(心悸、胸悶、心音低、心臟雜音、心動(dòng)過速、心動(dòng)過緩)；檢查心電圖,用活動(dòng)平板分析儀進(jìn)行運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)(采用bruce方案)；心肌酶學(xué)用酶法測(cè)定,包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)、肌酸磷酸激酶(cpk)及乳酸脫氫酶(ldh)；并檢測(cè)肝功能及尿素氮。療程結(jié)束后復(fù)查上述檢查。

1.5  療效標(biāo)準(zhǔn)

    治愈：癥狀、體征消失,心電圖及心肌酶學(xué)恢復(fù)正常；顯效：癥狀、體征改善,積分值較治療前減少1/3,心肌酶學(xué)有1項(xiàng)以上改善；無(wú)效：治療結(jié)束后癥狀、體征及心肌酶學(xué)均無(wú)改善或達(dá)不到上述標(biāo)準(zhǔn)者。

1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

   

所測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)用spss12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示,計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)。

2  結(jié)果

(見表1～表3)表1  2組放射性心肌炎患者臨床療效比較(略)注：2組比較,p<0.01。表2  2組放射性心肌炎患者治療前后主要癥狀、體征積分及運(yùn)動(dòng)代謝當(dāng)量、運(yùn)動(dòng)時(shí)間比較(略)注：與本組治療前比較,p<0.05,p<0.01；與對(duì)照組治療后比較,p<0.05(下同)。表3  2組放射性心肌炎患者治療前后心肌酶學(xué)變化比較(略)

3  討論

   

從中醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)來看,放射線是一種毒熱性殺傷因素。熱能化火,火熱可以灼傷、消耗人體的而致病。這種熱毒之邪來勢(shì)兇猛、險(xiǎn)惡,極易傷陰耗氣,致使人體正氣不足、抗病能力下降。黃芪具有益氣養(yǎng)陰、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈之作用。黃芪含有黃芪多糖、葡萄糖醛酸、多種氨基酸、葉酸、黃芪苷等有效成分,具有顯著的增強(qiáng)心肌收縮力、改善微循環(huán)、擴(kuò)張血管、增加心肌血流量、降低血壓而起到保護(hù)心肌和改善心功能的作用；可抑制腫瘤壞死因子表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡,具有明顯糾正心力衰竭作用[2]。其作用機(jī)制可能與下列因素有關(guān)：①大劑量的黃芪皂苷抑制心肌細(xì)胞na＋-k＋-atp酶活性,從而間接抑制na＋-ca2＋交換,使ca2＋濃度增高,或抑制磷酸二酯酶活性,使心肌中環(huán)磷酸腺苷(camp)濃度升高,ca2+內(nèi)流增加,而呈正性肌力作用；②黃芪多糖和黃芪皂苷能夠改善心肌代謝,降低細(xì)胞耗氧量,維持氧的供求平衡,提高心肌耐缺氧能力,保護(hù)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),穩(wěn)定線粒體功能,改善細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)；③直接抑制或清除自由基的產(chǎn)生,保護(hù)心肌超氧化物歧化酶等酶的活性,提高心肌抗氧化能力,減輕細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化狀態(tài)；④通過抑制磷酸二酯酶的活性,使血小板內(nèi)camp水解減少,含量升高,從而抑制血栓形成及降低血小板粘附率。

    本觀察結(jié)果表明,黃芪對(duì)放射所致的心臟損傷具有較好的治療作用,能顯著降低alt、ldh,減少放射所致心肌損傷,并且能增加患者的運(yùn)動(dòng)耐

量,提高腫瘤患者的生活質(zhì)量。

【參考文獻(xiàn)】

第4篇：黃芪的作用范文

【摘要】

目的：研究黃芪復(fù)方對(duì)大鼠主動(dòng)型Heymann腎炎的治療作用，并探討其作用機(jī)制。方法：大鼠腹腔注射同種腎臟免疫復(fù)合物，復(fù)制大鼠主動(dòng)型Heymann腎炎模型，觀察灌胃給予黃芪復(fù)方三種劑量1.5、0.75、0.375g浸膏/kg（折合生藥4、2、1g/kg），治療大鼠H基殘留凍土層eymann腎炎4周，對(duì)Heymann腎炎模型的作用。結(jié)果：①能明顯降低腎炎大鼠尿蛋白，血清肌酐與尿素氮，能升高血清總蛋白與白蛋白水平；②能明顯提高血清SOD活性和降低血漿MDA含量；③能使腎炎大鼠降低的胸腺及脾臟指數(shù)以及脾淋巴細(xì)胞ConA增殖反應(yīng)恢復(fù)，使IL-1水平明顯降低。結(jié)論：黃芪復(fù)方對(duì)大鼠Heymann腎小球腎炎有明顯的保護(hù)作用，該療效可能與其抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 黃芪復(fù)方 大鼠 Heymann腎炎

Effects of Huang-Qi-fu-fang on Heymann nephritis in rats

【Abstract】Objective:In order to study the effects of huang-qi-fu-fang on nephritis in rats and the reasonality of the compound and try to find out the mechanisms of Huang-qi-fu-fang.Methods:The rat models of AHN were induced by intra peritoneal administration of kidney homogenate and Freund's adjuvant.We studied the effects of huang-qi-fu-fang which was given orally at the dosages of 4，2，1g/kg crude drug body weight on Heymann nephritis for 4 weeks in rats.Results:①the levels of proteinuria and blood urea nitrogen and creatinine in all treated groups were remarkedly decreased.②The concentrations of serum cholesterol and triglycerides and plasma，MDA were obviously descreased after treatment ，but the levels of serum total protein and albumin and the activity of SOD were mardedly increased. ③this compound could restore the diminshed indexes of thymus and spleen，proliferative response to splenocyte induced by Con A and enhanced IL-1 production by peritoncal macorophages in HG rats.Conclusion:The protective offects of Huang-qi-fu-fang on Heymann nephritis in rats were associated with its anti-inflammatory，anti-oxidative and immunomodulatory activities.

【Key word】Huang-qi-fu-fang rat Heymann nephritis

1 前言

黃芪復(fù)方是以黃芪為主藥與另二味中藥組成的復(fù)方，黃芪被歷代視為補(bǔ)氣要藥[1]。本草綱目記載“可治一切氣衰血虛諸證”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪具有降壓、利尿、強(qiáng)心、抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等作用。單獨(dú)或與其他藥配伍用于治療慢性腎炎，在臨床上取得了較為滿意的效果。目前醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為免疫學(xué)機(jī)制、腎血凝障礙及氧自由基代謝失衡等在腎炎的發(fā)病機(jī)理中具有重要作用[2]。本文采用大鼠主動(dòng)型Heymann腎小球腎炎模型以及多項(xiàng)指標(biāo)，觀察黃芪復(fù)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性腎炎的防治作用，為本方的氣血雙補(bǔ)、活血促消治療慢性腎炎的論點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 動(dòng)物

Wistar大鼠，體重150～200g，雌雄各半，購(gòu)自安徽省醫(yī)研所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證:皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字03號(hào)；C57BL6小鼠，3月齡，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字01號(hào)。

2.2 藥品及試劑

2.2.1 黃芪復(fù)方（浸膏）由合肥恒星藥物研究所提供，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）制成混懸液供灌胃（ig）給藥。

2.2.2 地塞米松（DXM），四川巴中制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)990524，使用前用0.5%CMC-Na配成所需濃度。

2.2.3 卡介苗，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)980012，規(guī)格60mg/支。

2.2.4 SOD測(cè)定試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

2.2.5 ConA，LPS均為Sigma產(chǎn)品。

2.2.6 [3H]TdR，比放射活性為666TBq.mol－1，中國(guó)原子能原研究院產(chǎn)品。

2.2.7 RPMI1640培養(yǎng)粉為Gibco公司產(chǎn)品。

2.2.8 小牛血清，安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供。

2.2.9 牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司產(chǎn)品。

2.3 儀器和設(shè)備

2.3.1 GL20A型全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)，湖南儀器總廠離心機(jī)廠生產(chǎn)。

2.3.2 CX-7型全自動(dòng)血液生化分析儀，美國(guó)Backman公司產(chǎn)品。

2.3.3 LBYN-6＋旋轉(zhuǎn)式血液粘度儀，北京普利生集團(tuán)公司產(chǎn)品。

2.3.4 Napco-6100型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Precision Scientific公司產(chǎn)品。

2.3.5 FJ2107液體閃爍計(jì)數(shù)儀，西安262廠生產(chǎn)。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

Heymann腎炎模型的建立[3]：取大鼠60只，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、模型組；地塞米松（DXM）組；黃芪復(fù)方高、中、低劑量組（4、2、1g.生藥/kg）。取卡介苗8支，置滅菌瑪瑙缽中，加滅菌液體石蠟16ml，充分捻磨使之完全乳化，制成Freund's完全佐劑（濃度30mg.ml－1）備用。取腎皮質(zhì)5g制成勻漿與弗氏完全佐劑混合成10ml，加生理鹽水20ml，除正常對(duì)照組外，每鼠腹腔注射2ml，兩周一次，自第4周大鼠蛋白尿明顯出現(xiàn)起，灌胃給藥，每日一次，連續(xù)四周。

2.5 觀測(cè)指標(biāo)

2.5.1 每日觀察動(dòng)物的一般情況，每周稱體重一次，并以此來調(diào)整用藥量。

2.5.2 尿蛋白的測(cè)定：采用磺柳酸比濁法作24小時(shí)尿蛋白定量，實(shí)驗(yàn)前測(cè)一次，實(shí)驗(yàn)開始后第1、2、3、4、6、7周各測(cè)一次。

2.5.3 血液生化測(cè)定：治療結(jié)束后24小時(shí)采血測(cè)定甘油三酯（TG）、總膽固醇（TCH）、極低密度脂蛋白（VLDL）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。采用CX-7型全自動(dòng)血液生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.5.4 血漿丙二醛（MDA）含量的測(cè)定[4]：治療停止后24小時(shí)采血，取血漿1ml，加入30%TCA1ml，搖勻后靜置5min，加入0.67%TBA2ml，煮沸30min，冰水冷卻。離心（2000rpm）10min，上清液于535nm處測(cè)吸光度值。

2.5.5 血清SOD活性測(cè)定：治療停止后24小時(shí)采血，取血清測(cè)定SOD活性，采用放射免疫法，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2.5.6 臟器系數(shù)及病理組織學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取每鼠兩側(cè)腎臟、胸腺、脾臟稱重。分別按g/100g體重計(jì)算各臟器系數(shù)（%）。取各組腎標(biāo)本作HE染色，光鏡檢查。

2.5.7 大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：無(wú)菌取脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液（1×107.ml－1細(xì)胞）。在96孔培養(yǎng)板上，每孔加入脾細(xì)胞懸液100ul（終濃度為5×106ml－1）、ConA50ul（終濃度3ug.ml－1）或LPS50ul（終濃度6ug.ml－1）置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，終止前6h，每孔加入[3H]TdR1.4×104Bq，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞于69型纖維濾紙上，在液閃儀上測(cè)cpm值，結(jié)果以3個(gè)復(fù)孔cpm的均值表示。

2.5.8 IL-1的產(chǎn)生與檢測(cè)

2.5.8.1 IL-1的產(chǎn)生：以RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)制備大鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液（2×106.ml－1），在24孔培養(yǎng)板上，加入腹腔巨噬細(xì)胞懸液1ml置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，吸棄培養(yǎng)液，以溫Hank's液（37℃，含5%小牛血清）輕洗三次，除去非粘附細(xì)胞，獲單層M￠，每孔分別加入內(nèi)含LPS的RPMI-1640培養(yǎng)液1ml（終濃度6ug.ml－1）。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后，去上清，以溫Hank's 液輕洗一次，每孔加入RPMI-1640培養(yǎng)液1ml，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)42h后，4℃離心（2000rpm，10min），收集上清，即為含IL-1活性的上清液，待測(cè)。

2.5.8.2 IL-1的檢測(cè)：用小鼠胸腺細(xì)胞增殖法檢測(cè)IL-1，取正常C57BL6小鼠，無(wú)菌取胸腺，以RPMI-1640培養(yǎng)液制成2×107.ml－1細(xì)胞懸液，在96孔培養(yǎng)板上，每孔加入稀釋30倍的IL-1待測(cè)上清100ul，每一樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入脾細(xì)胞懸液50ulCooA50ul（終濃度3ug.ml－1），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)，終止培養(yǎng)前6h，每孔加20ul[3H]TdR。培養(yǎng)結(jié)束后，用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于69型纖維濾紙上，在液閃儀上測(cè)定放射性，結(jié)果以3個(gè)復(fù)孔cpm的均值表示。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均用x±s表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)動(dòng)物一般狀況及體重的影響：與正常對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物于造模一周左右出現(xiàn)毛發(fā)疏松，無(wú)光澤，精神萎靡，體重明顯下降。黃芪復(fù)方三個(gè)劑量組的大鼠的體重均有不同程度的恢復(fù)，見表1。表1 黃芪復(fù)方對(duì)Heymann腎炎大鼠體重的影響（略）注：與正常組比較，P＜0.05 ；與模型組比較，﹡P＜0.05。

3.2 對(duì)大鼠24小時(shí)尿蛋白的動(dòng)態(tài)變化的影響：各組試驗(yàn)前24小時(shí)尿蛋白含量均＜24mg/24h。正常對(duì)照組在試驗(yàn)開始后第1、2、3、4、5、6、7wk尿蛋白與試驗(yàn)前均無(wú)顯著性差異。模型組于開始建模后第一周末尿蛋白開始增加，其后逐周遞增，第6周達(dá)峰值，DXM及黃芪復(fù)方各劑量組均明顯降低，黃芪復(fù)方高劑量組的降尿蛋白作用尤為突出，見表2。表2 黃芪復(fù)方對(duì)Heymann腎炎大鼠24小時(shí)尿蛋白動(dòng)態(tài)變化的影響（略）注：與正常組比較，P＜0.01；與模型組比較﹡P＜0.05；﹡﹡P＜0.01。

3.3 對(duì)大鼠血清蛋白質(zhì)、腎功能和血脂的影響：模型組大鼠血清TP和ALB均明顯降低，TCH、TG、VLDL、BUN、Cr均明顯升高，黃芪復(fù)方高、中劑量組能明顯升高TP及ALB，明顯降低TCH、TG、VLDL以及明顯改善腎功能，使BUN、Cr降低，低劑量組可明顯升高TP與降低TCH，對(duì)上述其他指標(biāo)亦有一定改善，提示本藥可改善Heymann腎炎大鼠的腎功能，并有降低血脂和升高血清蛋白質(zhì)的作用，見表3。表3 黃芪復(fù)方對(duì)Heymann腎炎大鼠血清蛋白質(zhì)、腎功能和血脂的影響（略D)注：與正常組比較，P＜0.01；與模型組比較﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01。

3.4 對(duì)大鼠血漿MDA含量和血清SOD活性的影響：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿MDA含量明顯升高，SOD活性明顯下降，DXM及黃芪復(fù)方各劑量均能提高SOD活性和降低MDA含量，提示本藥有明顯抗氧化作用，見表4。表4 黃芪復(fù)方對(duì)Heymann腎炎大鼠血漿MDA含量與血清SOD活性的影響（略）注：與正常組比較，P＜0.01，與模型組比較﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01。

3.5 對(duì)大鼠免疫功能的影響：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的胸腺及脾臟系數(shù)明顯降低，大鼠脾淋巴細(xì)胞的ConA增殖反應(yīng)明顯降低，腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1明顯增加，黃芪復(fù)方高、中劑量組能使降低的胸腺及脾臟系數(shù)恢復(fù)，黃芪復(fù)方高劑量組能使Heymann腎炎大鼠脾臟淋巴細(xì)胞ConA增殖反應(yīng)恢復(fù)，使升高的IL-1水平明顯降低。提示本方有明顯的機(jī)能依賴性的免疫調(diào)節(jié)作用，見表5、表6。表5 黃芪復(fù)方對(duì)Heymann腎炎大鼠免疫器官臟器系數(shù)的影響(略)注：與正常組比較，P＜0.05，與模型組比較，﹡P＜0.05。表6 黃芪復(fù)方對(duì)Heymann腎炎大鼠脾臟淋巴細(xì)胞ConA增殖反應(yīng)和IL-1的影響（略） 10.581±2.102﹡

注：與正常組比較，P＜0.01；與模型組比較，﹡P＜0.01。

3.6 對(duì)大鼠腎臟系數(shù)及其病理組織學(xué)改變的影響：模型組大鼠的腎臟系數(shù)明顯增加，提示病變腎臟腫脹明顯，黃芪復(fù)方高、中劑量組能明顯降低腎臟系數(shù)，見表5。

病理組織學(xué)檢查表明經(jīng)HE染色，模型組大鼠的腎小球毛細(xì)血管壁明顯增厚，部分腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度增生，經(jīng)PASM/Masson染色，可見腎小球毛細(xì)血管基底膜中心重度增生，腎近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)可見多量脂滴，表明建模成功。黃芪復(fù)方中、高劑量組的上述病變均有不同程度的減輕，尤其是高劑量組經(jīng)HE染色可見腎小球毛細(xì)血管壁輕度增厚；PASM/Masson染色，可見腎小球基底膜輕度增厚。提示本方對(duì)大鼠Heymann腎炎的腎病理組織學(xué)變化有明顯的改善作用，見圖1～8。

4 討論

目前，我國(guó)的腎小球腎炎仍然是影響人們身體健康的重要原因之一，每年因腎小球腎炎而進(jìn)入終末期腎衰的患者居各病因之首[5]。治療腎小球腎炎通常使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗凝等藥物，但對(duì)不同病理類型的腎炎其療效尚不能令人滿意，而且某些藥物的不良反應(yīng)亦難以避免。故開發(fā)治療慢性腎炎的有效藥物，將有廣闊市場(chǎng)。

Heymann腎炎模型長(zhǎng)期以來一直是用于研究人類膜性腎病的一個(gè)經(jīng)典動(dòng)物模型。因其發(fā)病迅速、病變穩(wěn)定，可用來觀察藥物的療效。制備該動(dòng)物模型有主動(dòng)型和被動(dòng)型Heymann腎炎兩種，主動(dòng)型Heymann腎炎動(dòng)物模型用自體或同種動(dòng)物腎勻漿加完全弗氏佐劑給大鼠腹腔注射，兩周一次，動(dòng)物出現(xiàn)大量蛋白尿?yàn)槠涮卣鳌?/p>

本研究采用了主動(dòng)型Heymann腎炎，觀察造模成功后給予黃芪復(fù)方對(duì)模型動(dòng)物的影響。結(jié)果表明：①黃芪復(fù)方能明顯改善Heymann腎炎模型鼠的腎臟病變，降低模型大鼠的腎臟系數(shù)，并明顯改善其病理組織學(xué)變化，明顯降低尿蛋白排泄量；②明顯升高血清總蛋白、白蛋白水平；③改善腎功能，使升高的血清肌酐與尿素氮明顯降低；④使血清SOD活性升高，MDA含量降低；⑤使對(duì)Heymann腎炎大鼠降低的胸腺和脾臟系數(shù)，以及脾淋巴細(xì)胞ConA增殖反應(yīng)恢復(fù)，使腹腔巨噬細(xì)胞過高產(chǎn)生IL-1的水平明顯降低。提示該方對(duì)Heymann腎炎模型有明顯的療效，其作用機(jī)制可能與黃芪復(fù)方具備抗氧化作用[6]，減輕氧自由基及脂質(zhì)過氧化物對(duì)腎臟的損害，從而降低腎小球?yàn)V過膜通透性，從而減少尿蛋白；抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用[7～9]，影響炎癥因子的合成、釋放，減輕腎臟的炎癥反應(yīng)；改善機(jī)體代謝，促進(jìn)機(jī)體的恢復(fù)[10、11]等作用有關(guān)。

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第5篇：黃芪的作用范文

【關(guān)鍵詞】 黃芪注射液；，，基因報(bào)告系統(tǒng)；，，雌激素受體；，，HeLa細(xì)胞；，，配體結(jié)合域

摘要：目的構(gòu)建含有雌激素受體配體結(jié)合域的哺乳動(dòng)物細(xì)胞雜交基因報(bào)告系統(tǒng)，研究黃芪注射液對(duì)雌激素受體（ER）活性的影響。方法 PCR擴(kuò)增雌激素受體配體結(jié)合域，將配體結(jié)合域克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒 pCMV-BD構(gòu)建細(xì)胞雜交基因報(bào)告系統(tǒng)，研究黃芪注射液與雌激素受體的關(guān)系；MTT法檢測(cè)黃芪注射液對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果成功構(gòu)建含有雌激素受體配體結(jié)合域的哺乳動(dòng)物細(xì)胞雜交基因報(bào)告系統(tǒng)，黃芪注射液不能提高細(xì)胞活性，但對(duì)雌激素受體具有激活作用。結(jié)論黃芪注射液可能通過雌激素受體發(fā)揮療效，細(xì)胞雜交基因報(bào)告系統(tǒng)是研究中藥作用機(jī)理的手段之一。

關(guān)鍵詞：黃芪注射液； 基因報(bào)告系統(tǒng)； 雌激素受體； HeLa細(xì)胞； 配體結(jié)合域

Activating Effect of Astragalus Injection on Estrogen Receptor

Abstract:ObjectiveTo establish the Gal4DBD-ER or ERLBD report system to study the effect of Astragalus Injection on ERs.MethodsGene report system was generated by amplifying the ligand binding domain(LBD ) with Pfu polymerase and subcloning the product into the eukaryotic expression vector pCMVBD. This system was employed to study the relationship between Astragalus Injection and ERs. Cell activity were detected by MTT.ResultsGene reporter system using ER-LBD is established. Astragalus Injection can not improve cell activity but can activate ERs activation.ConclusionThe mechanisms of Astragalus Injection may be related to its effect of activating ERs. Gene report system can be used to study the mechanisms of Chinese traditional medicine.

Key words:Astragalus Injection； Gene Report system； Estrogen receptor； HeLa cell； Ligand binding domain

雌激素受體（Estrogen receptor， ER）是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子， 屬甾體激素受體家族成員，調(diào)控基因表達(dá)。ER在1967 年被首次發(fā)現(xiàn)［1］， 20 多年來， 它作為內(nèi)分泌治療的預(yù)測(cè)因子被廣泛應(yīng)用。1996 年 ERα首次從大鼠中克?。?］，其后人和小鼠也相繼發(fā)現(xiàn) ERβ的表達(dá)［3，4］。ERα和 ERβ的結(jié)構(gòu)、功能存在差異， 在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同作用［5］ 。因而研究藥物對(duì)雌激素受體的作用，將有利于我們認(rèn)識(shí)藥物的作用機(jī)理。黃芪主要有補(bǔ)氣的作用，在臨床上主要治療以氣虛為主證的疾病，在處方中多以君藥出現(xiàn)，具有補(bǔ)中益氣、補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表的作用。為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)理，本研究采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞雜交技術(shù)研究黃芪注射液對(duì)雌激素受體配體結(jié)合域的作用，探討黃芪對(duì)雌激素受體的部分作用。

1 材料與方法

1.1 材料Hela 細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿研究員贈(zèng)送；DMEM無(wú)血清、無(wú)酚紅培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購(gòu)自 Hyclone公司；Lipofactemine2000購(gòu)自 Invitrogen公司；SteadyGlo熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Promega公司；細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自 Corning Costar公司；MTT購(gòu)自 Molecular公司； 黃芪注射液(上海禾豐藥業(yè))。

1.2 PCR 擴(kuò)增 hERa-LBDcDNA

根據(jù) gene bank報(bào)道的 ERs序列（M12674和NM001437），設(shè)計(jì) hERa-LBD和 hERb-LBD cDNA 序列的引物，在5’端引入一個(gè) BamH Ⅰ的酶切位點(diǎn)，在 hERa-LBD的3’端引入一個(gè) Eco R Ⅰ的酶切位點(diǎn)， 在 hERb-LBD的3’端引入一個(gè) Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)，引物序列如下。上游5’GCGGATCCGGAGGGAGAATGTTGAAAC3’下游　5’GCGAATTCTCAGACTGTGGCAGGGAAAC3’；Human ERβLBD引物序列：上游5’GCGGATCCGGCAAGGCCAAGAGAAGTG3’下游5’　GCAAGCTTTCACTGAGACTGTGGGTTC3’。以 cmxp-ERa和 cmxp-ERb 全長(zhǎng) cDNA 質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，5 min ；94 ℃，1 min ；55 ℃，1 min ；72 ℃，2 min ； 72 ℃，7 min循環(huán)20次；PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1 % 瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化并回收所需 DNA 片段，純化的 DNA 溶解在50 μl 的 TE 緩沖液中。

1.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒 pCMV-hER LBD的構(gòu)建

用 BamH Ⅰ和 EcoRI雙酶切 PCR 產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收純化 DNA ，加入經(jīng)相同雙酶切處理、凝膠純化回收的 pCMV-BD載體，經(jīng)過連接反應(yīng)，構(gòu)建成 pCMV-Gal4 hERaLBD 和 pCMV-Gal4 hERβLBD質(zhì)粒。反應(yīng)體系為：pCMV-BD 2μl (50 ng ) ， hERaLBD或 hERβLBD 6 μl (100 ng) ，10 ×連接緩沖液1 μl ，T4 DNA 連接酶1 μl (3 U) ；16℃過夜連接； 將1 μl 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。小量提取質(zhì)粒，雙酶切消化，1 % 瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒并測(cè)定序列。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清采用 Charcoal-strip處理，人子宮癌細(xì)胞系 Hela培養(yǎng)在含10% Charcoal-Strip胎牛血清及抗生素（青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml）的無(wú)酚紅 DMEM 培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2 的 二氧化碳培養(yǎng)箱濕潤(rùn)培養(yǎng)。

1.5

MTT檢測(cè)黃芪注射液對(duì) Hela細(xì)胞增殖能力的影響細(xì)胞以104個(gè)/孔接種至96孔板，分成4組，每組12孔，利用含有10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h之后，向培養(yǎng)液中分別加入不同濃度(0.001%，0.01%，0.1%)的黃芪注射液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用噻唑藍(lán) (MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞的增殖能力。

1.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以104/孔傳代于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，長(zhǎng)到80%～90%滿時(shí)用于轉(zhuǎn)染。用優(yōu)化培養(yǎng)液MEM稀釋 lipoFectamine 2000 試劑（ 0.5 μl/100 μl ）和質(zhì)粒 DNA。優(yōu)化培養(yǎng)液稀釋后質(zhì)粒濃度分別為：pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERβLBD，25 ng/孔; pFR-Luci，50 ng/孔; pFRTlaczeo plasmid， 50 ng/孔。lipoFectamine 2000稀釋5 min后，將稀釋后的脂質(zhì)體和質(zhì)粒 DNA 等體積混合，于室溫放置20 min。迅速將細(xì)胞換液成含有10％Charcoal-Strip胎牛血清的無(wú)酚紅 DMEM 100 μl。再加入脂質(zhì)體/ DNA 混合物，將槍頭深入液面下，逐滴加入，并輕輕搖晃混勻。

1.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物處理及檢測(cè)將黃芪注射液溶于 DMSO中，在細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒6 h后，分別加入不同濃度的黃芪注射液，并以 DMSO為對(duì)照。放于5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后根據(jù) Promega公司 Steady-Glo kit說明書測(cè)定細(xì)胞的熒光值，并以 β-Gal作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，測(cè)定 β-Gal活性。

1.8 數(shù)據(jù)處理 用 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包中的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均用 ±s表示，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次或3次以上。

2 結(jié)果

2.1 hERa-LBD和 hERβ-LBD的 PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在1 024 bp和883 bp處有特異性擴(kuò)增條帶，片段大小與預(yù)期值相符。結(jié)果見圖1。序列分析結(jié)果顯示得到的克隆基因序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

M：Marker DL2000 A和B：ERa LBD C和D：ERβ LBD

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（略）

2.2 pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERβLBD的酶切分析重組質(zhì)粒 pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERbLBD經(jīng)限制酶 BamH Ⅰ和Eco RI（Hind III）雙酶切后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示酶切片段與預(yù)期值相符。結(jié)果見圖2。并將質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別與報(bào)道的 hERaLBD和 hERβLBD序列一致。

M： DL2000 Marker ERa：pCMV-Gal4 hERaLBD酶切結(jié)果　ERb：pCMV-Gal4 hERβLBD酶切結(jié)果

圖2 pCMV-Gal4 hERaLBD和pCMV-Gal4 hERβLBD經(jīng)雙酶切之后瓊脂糖電泳圖（略）

2.3 黃芪注射液對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響HeLa細(xì)胞在高濃度（0.001%~0.1%）黃芪注射液作用24 h后，黃芪注射液不能提高細(xì)胞活力，低、高劑量與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）的差異。結(jié)果見圖3。

2.4 黃芪注射液對(duì)雌激素受體配體結(jié)合域的激活作用 通過 Gal4DBD-ERα和 ERβ LBD 細(xì)胞雜交報(bào)告系統(tǒng)，本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可以在高劑量（0.1%）顯著地提高ERα的活性，但是小于0.01%的情況下無(wú)激活ERα活性的作用，高、低劑量的黃芪注射液對(duì)ERβ均有明顯的激活的作用。結(jié)果見圖 4。

圖3 MTT法檢測(cè)不同劑量黃芪注射液對(duì)Hela細(xì)胞增殖能力的影響（略）

a不同劑量黃芪注射液對(duì) ERα的激活作用

b不同劑量黃芪注射液對(duì) ERβ的激活作用

圖4 黃芪注射液對(duì) ERs活性的影響（略）

3 討論

我國(guó)中藥具有數(shù)千年的歷史，而且安全性高、副作用低，因此具有很好的發(fā)展前景，但對(duì)中醫(yī)藥有效成分的分析與研究還是處在早期階段，使得我國(guó)中藥的發(fā)展受到很大的限制，需要建立一個(gè)國(guó)際認(rèn)可的、現(xiàn)代化的中藥機(jī)理研究體系，來進(jìn)行中藥作用機(jī)理的研究。核受體家族基礎(chǔ)研究的進(jìn)展促進(jìn)了新的受體病的發(fā)現(xiàn)， 擴(kuò)大了對(duì)激素抵抗機(jī)制的認(rèn)識(shí)， 為藥物的設(shè)計(jì)和疾病的治療提供了新思路［6］。核受體一般有6個(gè)功能區(qū)，其中與配體發(fā)生相互作用的是E/F區(qū)，核受體的配體結(jié)合域便有此區(qū)編碼。雌激素受體是核受體中的一種，同樣具有核受體的特征，具有與配體結(jié)合的配體結(jié)合域。因而可以通過細(xì)胞雜交基因報(bào)告系統(tǒng)，研究中藥有效成分與雌激素配體結(jié)合域的相互作用，確定中藥作為 ERα與 ERβ選擇性配體的功能，分析中藥作為促效或拮抗藥的機(jī)理。所以通過克隆雌激素受體配體結(jié)合域構(gòu)建細(xì)胞雜交基因報(bào)告系統(tǒng)對(duì)研究中藥與雌激素受體的關(guān)系具有重要的作用。黃芪為豆科植物蒙古黃芪的根， 主要化學(xué)成分為蕊異黃酮、3-羥基-9， 10-二甲氧基紫檀烷、黃芪皂苷Ⅰ，Ⅴ，Ⅲ 等，部分成分屬植物雌激素類。中醫(yī)認(rèn)為黃芪注射液是具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕之功， 主要用于治療心氣虛損、血脈痰阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虛濕困之肝病。近年臨床上還拓展應(yīng)用于肝硬化、腦血管疾病、腎臟疾病，對(duì)其抗腫瘤機(jī)制也進(jìn)行了大量研究。已知機(jī)理之一是黃芪通過紅細(xì)胞C3b 受體活性增加， 免疫粘附功能增強(qiáng)， 自然殺傷(NK) 細(xì)胞具有廣譜抗腫瘤活性，從而刺激體內(nèi)免疫細(xì)胞提高機(jī)體抗腫瘤作用［7，8］。在本研究中，實(shí)驗(yàn)證明黃芪注射液并不能顯著地使 Hela細(xì)胞增殖。利用高保真Taq酶克隆到兩種雌激素受體亞型的配體結(jié)合域，并將其成功克隆到含有 Gal4 DNA 結(jié)合域的真核表達(dá)質(zhì)粒中，利用細(xì)胞雜交基因報(bào)告系統(tǒng)研究了黃芪注射液對(duì)雌激素受體的作用。發(fā)現(xiàn)黃芪注射液在高、低劑量下均可顯著提高雌激素受體ERβ的活性，只有高劑量下才可激活雌激素受體ERα的活性。由此推測(cè)，黃芪注射液可能是通過，至少部分通過雌激素受體發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞活力增加，并在治療各種疾病中發(fā)揮療效。文獻(xiàn)報(bào)道蕊異黃酮、黃芪皂苷是生物活性較弱的雌激素， 可以與人體ER結(jié)合形成ER2復(fù)合物， 通過核內(nèi)轉(zhuǎn)錄通路， 即在細(xì)胞核內(nèi)利用DNA反應(yīng)元件的基因轉(zhuǎn)錄， 翻譯成效應(yīng)蛋白， 起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)， 取代完整的雌激素反應(yīng)［9］。黃芪因濃度不同分別起雌激素和抗雌激素的雙相作用。低濃度(1×10-5～1×10-8)mol/L時(shí)表現(xiàn)出雌激素作用， 而高濃度(1×10-4～ 1×10-5) mol/L時(shí)則表現(xiàn)出抗雌激素作用。其類似雌激素作用是由ER介導(dǎo)的， 標(biāo)志是刺激肽合成酶2 (PS2)mRNA 的表達(dá); 而抗雌激素作用并不由 ER介導(dǎo)， 在 ER陰性細(xì)胞中仍然表現(xiàn)出抗增生作用［10］。本研究首先成功構(gòu)建了含有雌激素受體配體結(jié)合域的細(xì)胞雜交基因報(bào)告系統(tǒng)，并成功研究了黃芪注射液與雌激素受體的關(guān)系，為將來中藥作用機(jī)理的研究提供了一個(gè)新的思路和技術(shù)平臺(tái)。

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第6篇：黃芪的作用范文

摘 要:目的:探討黃芪甲苷(AS-IV)對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。方法:條件性永生的小鼠足細(xì)胞分為正常糖組(NG)、高糖組(HG)、甘露醇高滲對(duì)照組(MA)及HG+不同劑量(10、50、100 μg/mL)黃芪甲苷干預(yù)組(AS-IV)。流式細(xì)胞儀及Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡;熒光探針CM-H2-DCF-DA標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)活性氧(ROS)水平;Western印跡檢測(cè)足細(xì)胞p38-MAPK活性。結(jié)果:高糖促進(jìn)足細(xì)胞ROS的產(chǎn)生并引起足細(xì)胞凋亡,AS-IV明顯抑制高糖誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生及足細(xì)胞凋亡,且呈劑量依賴關(guān)系。此外,高糖激活p38-MAPK信號(hào)通路,AS-IV呈劑量依賴性抑制p38-MAPK活性。結(jié)論: AS-IV能減少高糖所致的足細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與AS-IV抗氧化及抑制p38-MAPK活化密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞:黃芪甲苷;高糖;足細(xì)胞;凋亡;活性氧;p38-MAPK

中圖分類號(hào):R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1673-7717(2010)04-0822-03

Astragaloside IV Inhibited High Glucose-Induced Podocyte Apoptosis and Its Mechanism

GUI Dingkun1,CHEN Jianguo1,CHEN Yifang1,HUANG Jianhua2

(1.Department of Nephrology, Zhejiang Hospital, Hangzhou 310013,Zhejiang,China;

2.Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

Abstract:Objective: To study the effects of Astragaloside IV(AS-IV) on glucose-induced apoptosis of podocytes and explore its possible mechanism. Methods: Conditionally immortalized mouse podocytes were divided into nomal glucose group (NG) , high glucose group (HG), mannitol group (MA) and HG with 10, 50 and 100 μg/mL of AS-IV for 24h.Flow cytometry and Hoechst staning were used for the quantification of apoptotic podocytes. Reactive oxygen species (ROS) generation was measured with the fluoroprobe carboxymethyl-H2-dichlorofluorescein diacetate. The activation of p38-MAPK was determined by Western blot. Results: HG induced ROS generation and apoptosis of podocytes. AS-IV inhibited HG-induced ROS generation and apoptosis of podocytes in a dose-dependent manner. Moreover, HG caused p38-MAPK activation in podocytes, while AS-IV dose-dependently inhibited p38-MAPK activation.Conclusion: Astragaloside prevented high glucose-induced podocyte apoptosis and this effect may be involved in inhibition of ROS and p38-MAPK.

Key words:Astragaloside IV; high glucose; podocyte; apoptosis; ROS;p38-MAPK

收稿日期:2009-11-11

基金項(xiàng)目:浙江省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科群計(jì)劃項(xiàng)目(2008ZJ006)

作者簡(jiǎn)介:桂定坤(1978-),男,湖北孝感人,主治醫(yī)師,博士,從事腎臟病基礎(chǔ)與臨床研究。

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,若能早期干預(yù)治療DN,仍有希望阻止或延緩病情進(jìn)展,然而,迄今尚無(wú)滿意的防治早期DN的方法。近年來研究證實(shí)腎小球足細(xì)胞凋亡是早期DN進(jìn)展的關(guān)鍵[1],因此,抑制足細(xì)胞凋亡將為防治早期DN帶來新的曙光。DN屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“消渴”、“水腫”、“虛勞”等證范疇,關(guān)鍵病機(jī)為氣陰兩虛。黃芪益氣健脾、利水消腫,是臨床治療DN的常用中藥,黃芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)是黃芪的主要活性成分之一,筆者前期研究發(fā)現(xiàn)AS-IV能改善高糖刺激下的足細(xì)胞黏附,從而保護(hù)足細(xì)胞[2],本研究進(jìn)一步探討AS-IV對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器黃芪甲苷(成都思科華生物技術(shù)有限公司),RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),Hoechst-33342、小鼠γ-干擾素(美國(guó)Sigma), Trizol試劑、熒光探針CM-H2-DCF-DA(美國(guó)Invitrogen),p38、磷酸化p38抗體(美國(guó)Santa Cruz), ApoAlert Caspase 3熒光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD Bioscience), AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒 (上海晶美生物技術(shù)有限公司),熒光顯微鏡(日本Olympas),激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BIO RAD)。

1.2足細(xì)胞培養(yǎng)條件性永生的小鼠足細(xì)胞由英國(guó)Luigi Gnudi 教授 (King's College London School of Medicine, London, UK) 饋贈(zèng),按原始文獻(xiàn)方法[3]培養(yǎng),培養(yǎng)瓶預(yù)先經(jīng)01mg/mL膠原I在37℃處理1h,細(xì)胞生長(zhǎng)在含10U/mL γ-干擾素,10%胎牛血清,100U/mL青鏈霉素,100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,在5%CO2、33℃培養(yǎng)孵箱傳代培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入37℃、5%CO2培養(yǎng)孵箱分化14天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞處理及分組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的足細(xì)胞種植于經(jīng)膠原I處理的培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%時(shí),換1%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h同步化, 然后分為:①正常糖對(duì)照組(NG):D-葡萄糖5 mmol /L;②高滲對(duì)照組(MA):甘露醇25mmol /L+D-葡萄糖5 mmol /L;③高糖刺激組(HG):D-葡萄糖30 mmol /L;④高糖刺激+AS-IV干預(yù)組:不同劑量(10、50、100μg/mL)AS-IV干預(yù)24h。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) ① 流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率:上述已分化足細(xì)胞經(jīng)同步化處理后,根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞,然后用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次,細(xì)胞刀刮下重懸于1×結(jié)合緩沖液中,調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL,取100μL細(xì)胞懸液加入反應(yīng)管中,然后分別加入5μL AnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶(PI),輕輕混勻,避光室溫反應(yīng)15min,加入400μL 1×結(jié)合緩沖液,篩網(wǎng)過濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè),計(jì)算凋亡率。

② Hoechst-33342染色檢足細(xì)胞凋亡率:上述不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以甲醇、冰乙酸混合液(體積比為3∶1)固定10min,用PBS沖洗兩次,加入終濃度為5μg/mL的Hoechst-33342,避光室溫孵育30 min,30%緩沖甘油封片。然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察,各組隨機(jī)選取不重疊10個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比(凋亡率),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5足細(xì)胞ROS檢測(cè)用ROS特異性熒光探針CM-H2-DCF-DA標(biāo)記細(xì)胞ROS水平, 將上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞放入含10μmol/L CM-H2-DCF-DA的PBS中37℃孵化45 min,然后用PBS沖洗并收集細(xì)胞,用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)ROS水平。

1.6Western印跡分析足細(xì)胞p38-MAPK活性 收集上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以冷PBS洗滌兩次后分別裂解細(xì)胞,4℃ 15 000r/min離心10 min后留取裂解液上清,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。以12 %SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,電泳完畢后將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。室溫下以5%脫脂奶粉封閉, 用抗磷酸化p38MAPK抗體4℃孵育過夜, 然后再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h, DAB顯色。用ECL化學(xué)發(fā)光劑處理, 膠片曝光, 掃描并定量分析膠片條帶的光密度, 重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示,組間比較采用單因素方差分析,用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。P

2結(jié) 果

2.1 黃芪甲苷(AS-IV)對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)到高糖(HG)刺激24h后足細(xì)胞凋亡顯著增加(P

注:NG:正常糖對(duì)照組; MA:高滲對(duì)照組; HG:高糖刺激組

與NG組相比,*P

圖1 流式細(xì)胞儀(A)及Hoechst-33342染色(B)檢測(cè)

不同劑量黃芪甲苷(AS-IV)對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響

2.2AS-IV對(duì)足細(xì)胞ROS水平的影響 與NG組相比,HG組足細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加(P005), 而AS-IV能呈劑量依賴性減少足細(xì)胞ROS水平,在10μg/mL劑量時(shí)發(fā)揮作用,在100μg/mL劑量時(shí)達(dá)高峰(P

注:NG:正常糖對(duì)照組; MA:高滲對(duì)照組; HG:高糖刺激組。

與NG組相比,*P

圖2 不同劑量黃芪甲苷(AS-IV)對(duì)足細(xì)胞ROS水平的影響

2.3AS-IV對(duì)足細(xì)胞p38-MAPK活性的影響 與NG組相比,HG刺激顯著激活p38-MAPK信號(hào)通路(P0.05)。而AS-IV能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞p38-MAPK活化,其作用呈明顯劑量依賴關(guān)系,在100μg/mL劑量時(shí)作用最顯著(P

注:NG:正常糖對(duì)照組; MA:高滲對(duì)照組; HG:高糖刺激組。

圖3 不同劑量黃芪甲苷(AS-IV)對(duì)足細(xì)胞

p38-MAPK活化的影響

3討論

DN屬中醫(yī)“消渴”、“水腫”、“尿濁”、“虛勞”等范疇。病位在肝、脾、腎, 基本病機(jī)為氣陰兩虛,并兼夾瘀血、水濕、痰濁等標(biāo)證。本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜的病機(jī)特點(diǎn)和復(fù)雜的病機(jī)演化規(guī)律決定了DN中醫(yī)證型的多樣化。研究報(bào)道[4]認(rèn)為DN是在“消渴”氣陰兩虛的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,氣陰虛損、血瘀阻絡(luò)貫穿本病始終。黃芪有補(bǔ)氣升陽(yáng),固表止汗,利尿消腫等功效,一直作為治療DN的常用藥物在臨床中廣泛使用,黃芪甲苷(AS-IV)是黃芪的有效藥理成分之一,本研究首次發(fā)現(xiàn)AS-IV能明顯抑制高糖所致的足細(xì)胞凋亡,將為防治早期DN開辟一條新途徑。

大量研究表明DN早期就可出現(xiàn)足細(xì)胞凋亡,繼而加重疾病進(jìn)展,最近動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)1型及2型DN足細(xì)胞凋亡均顯著增加[5],且足細(xì)胞凋亡比足細(xì)胞脫落剝離、微量白蛋白尿及細(xì)胞外基質(zhì)增生發(fā)生更早,提示足細(xì)胞凋亡是早期DN進(jìn)展的新機(jī)制[1]。筆者采用流式細(xì)胞儀及Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,均發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷(AS-IV)能呈劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡,其中100μg/mL抑制作用最明顯,提示AS-IV對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡具有明確的抑制作用。

氧化應(yīng)激是引起早期DN進(jìn)展的重要機(jī)制,早期DN產(chǎn)生的氧化應(yīng)激以形成活性氧(ROS)為特征,現(xiàn)已證實(shí)ROS是引起足細(xì)胞凋亡的重要因素[1],高糖能直接促進(jìn)足細(xì)胞ROS的產(chǎn)生[6],并通過p38-MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[1]。AS-IV具有廣泛的藥理作用,抗氧化是AS-IV的重要研究領(lǐng)域之一,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)AS-IV有明確抗氧化作用,從而減輕心肌缺血損傷[7]。本研究發(fā)現(xiàn)AS-IV呈劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及足細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,提示AS-IV可能通過抗氧化作用抑制足細(xì)胞凋亡。

絲裂原激活的蛋白激酶( mitogen active protein kinase, MAPK)信號(hào)通路在早期DN足細(xì)胞凋亡中的作用越來越受到人們的關(guān)注。MAPK是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡過程的重要信號(hào)途徑, 包括p38-MAPK、c-Jun-N末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)等主要亞型。細(xì)胞外刺激經(jīng)過激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)將信號(hào)傳導(dǎo)至胞核而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡,在細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子和環(huán)境應(yīng)激的反應(yīng)過程中,MAPK信號(hào)通路起關(guān)鍵作用[8],其中p38在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞骨架重組中起至關(guān)重要的作用, p38激活可引起轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、細(xì)胞表面受體表達(dá)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)方面的過度變化,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]?，F(xiàn)已證實(shí)p38-MAPK信號(hào)通路異常激活是導(dǎo)致早期DN足細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。筆者發(fā)現(xiàn)高糖能顯著激活p38-MAPK信號(hào)通路,而AS-IV能抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞p38-MAPK活化,其作用呈明顯劑量依賴關(guān)系。ROS與MAPK激活之間的關(guān)鍵聯(lián)系可能與氧化應(yīng)激通過凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)酶-1(apoptosis signalregulatingkinase 1) 激活p38-MAPK有關(guān)[10],因此,筆者認(rèn)為AS-IV緩解高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的機(jī)制與其減少足細(xì)胞ROS水平及抑制p38-MAPK的活化密切相關(guān)。

綜上所述,筆者研究表明中藥黃芪的主要藥理成分AS-IV能顯著緩解高糖所致的足細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與AS-IV抗氧化及抑制p38-MAPK活化密切相關(guān),因此,AS-IV可能成為防治早期DN的潛在新型中藥單體,值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。

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第7篇：黃芪的作用范文

【關(guān)鍵詞】 黃芪多糖；胃癌細(xì)胞株SGC-7901；MTT

胃癌是消化道常見的腫瘤，是危害人類健康的主要疾病，居癌癥死亡原因的前5位。順鉑(cisplatin,CDDP)是臨床上治療腫瘤的基礎(chǔ)化療藥物，對(duì)腫瘤有較肯定的療效,但毒副作用較大。黃芪是傳統(tǒng)扶正固本的中藥，黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是從中提取的具有較強(qiáng)的生物活性的大分子化合物,研究顯示黃芪多糖具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)以人胃癌細(xì)胞株SGC-7901為試驗(yàn)對(duì)象研究黃芪多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖的抑制作用,為臨床腫瘤中藥治療用藥開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 (上海細(xì)胞資源中心)，培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清、0.1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)液中,37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育，每1～2 d更換1次培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基( Gibco公司)；新生胎牛血清( Fetal Bovin serum,FBS，蘭州民海生物工程有限公司)；順鉑（山東齊魯制藥廠）；胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO) 、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(均為Sigma公司產(chǎn)品)；黃芪多糖(西安鴻生生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)。

1.3 試驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；CO2 培養(yǎng)箱(日本三洋工業(yè)株式會(huì)社)；酶標(biāo)自動(dòng)分析儀BIO-RAD550型(美國(guó))；臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組 設(shè)空白對(duì)照組(不加細(xì)胞而只加培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照組（加二甲基亞砜 2‰DMSO）、順鉑用藥組（每孔加順鉑2 μg/mL)、黃芪多糖用藥組（每孔加入25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml的黃芪多糖，用2‰DMSO溶解)。孵育時(shí)間為12、24、48 h。

1.4.2 MTT法測(cè)細(xì)胞增值選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌SGC-7901細(xì)胞，用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至一定濃度，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×103 個(gè)/mL，接種于96 孔培養(yǎng)板,每孔200 μl,37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24 h后,分別加入含有不同濃度黃芪多糖及順鉑溶液，每孔加藥量為100 μl。培養(yǎng)12、24、48 h 后,每孔加入5 mg/mlMTT20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸去上清液,加入150 μl的DMSO液,在平板搖床上振蕩10 min,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)每孔吸光度(A),根據(jù)A值判定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用SPSS10.0軟件做單因素方差分析,（P

2 結(jié)果

黃芪多糖對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用（見表1）

黃芪多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖作用影響（x±s）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,2‰DMSO對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901無(wú)細(xì)胞毒作用,與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P>0.05)。黃芪多糖對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞株的增殖抑制有量效關(guān)系,并呈時(shí)間依賴性，與DMSO組相比,不同濃度黃芪多糖作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞株12 h對(duì)細(xì)胞株的增殖沒有明顯的抑制作用；作用24 h對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖有抑制作用(P

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。化療作為治療肺癌的手段之一在胃癌的綜合治療中占據(jù)著重要的地位。順鉑為胃癌化療中常用的藥物,但其對(duì)正常組織的具有毒性作用，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí),對(duì)某些正常組織也有一定的損害,故尋找高效低毒的腫瘤化療藥物及增敏劑以增強(qiáng)順鉑的化療效果是醫(yī)學(xué)工作者面臨的重要課題。

黃芪多糖是從中藥黃芪中提取的有效單體。大量研究顯示，黃芪多糖通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用：通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能來增強(qiáng)IL-2/LAK抗腫瘤作用；通過促進(jìn)抗癌素的分泌、IL-2R受體的表達(dá)、LAK前體細(xì)胞的增生而達(dá)到抗腫瘤作用［1］。周淑英等［2］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃芪多糖對(duì)小鼠移植性腫瘤、肝癌（Heps）均有明顯的抑制作用；與IL-2配伍應(yīng)用可以明顯提高LAK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞細(xì)胞的殺傷率，提示黃芪多糖抗腫瘤效應(yīng)可能主要與黃芪多糖具有增加機(jī)體免疫功能的作用有關(guān)。但也有實(shí)驗(yàn)證明黃芪多糖抗腫瘤作用是通過誘發(fā)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的［3］。黃芪多糖對(duì)肝癌BEL-7404細(xì)胞有殺傷作用，與順鉑聯(lián)合使用具有協(xié)同抗腫瘤作用［4］；對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝癌具有抑制作用［5］。

第8篇：黃芪的作用范文

關(guān)鍵詞：神經(jīng)干細(xì)胞；黃芪甲苷；增殖

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.015

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2013）05-0042-03

學(xué)基礎(chǔ)[1]。近來，很多研究表明，NSCs和神經(jīng)前體細(xì)胞的替代移植療法對(duì)治療腦和脊髓損傷、帕金森病及周圍神經(jīng)損傷等神經(jīng)組織疾病具有強(qiáng)大的應(yīng)用價(jià)值[2-5]。

中醫(yī)藥療法在神經(jīng)元保護(hù)和修復(fù)方面顯示了一定作用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃芪不同提取物具有抗氧化、抗炎、擴(kuò)張血管、改善腦血流等作用[6]。黃芪甲苷是從黃芪總苷中分離得到的一類單體化合物，是黃芪的主要活性成分之一。本實(shí)驗(yàn)采用黃芪甲苷對(duì)大鼠胚胎干細(xì)胞增殖作用進(jìn)行研究，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 培養(yǎng)基、試劑與藥物

HBSS液（無(wú)鈣離子和鎂離子，LONZA，USA）；DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)液（Hyclone Laboratories，USA）；B27添加物（GIBCO， USA）；重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，ProSpec-Tany， Isreal）；人表皮生長(zhǎng)因子（EGF，Strathmann Biotec， Germany）；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗，100×，Sigma）；Nestin小鼠單克隆抗體（Santa Cruz，USA）；BrdU小鼠單克隆抗體（Sigma， Germany）；ABC試劑盒（Vector Laboratories，USA）；DAB試劑盒（Vector Laboratories，USA）；黃芪甲苷、丹酚酸B（天津中一制藥）。

1.2 儀器

MCO-5M 型O2/CO2孵箱（Sanyo，Japan）；CK30倒置顯微鏡、IX70熒光倒置顯微鏡（Olympus，Japan）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代

孕16 d SD大鼠，脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒，無(wú)菌條件下打開腹腔，取出串珠狀子宮，浸泡于冷HBSS液中，取出胚胎，置于另一冷HBSS液中，小心剝離外層骨膜，取出大腦皮質(zhì)并去除軟腦膜，冷HBSS液漂洗2次，轉(zhuǎn)移至離心管加入一定量冷HBSS，吹打呈均勻懸濁狀，過200目（70 ?m）篩網(wǎng)，1000 r/min離心8 min，棄上清，以全培基（含2%B27，20 ?g/L bFGF，20 ?g/L EGF的DMEM/F12，1%雙抗的HBSS液）重懸，約3～4個(gè)胎鼠/75 cm2的密度種入培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d行半量換液1次。約5～9 d傳代1次。傳代后以1×105個(gè)/mL的密度全培基重懸種入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板。

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞亞代克隆Nestin鑒定

將經(jīng)過多次連續(xù)傳代所形成的亞代克隆細(xì)胞球接種于預(yù)先置有50 ?g/mL多聚賴氨酸涂層蓋玻片的6孔板中，貼壁生長(zhǎng)2 h。經(jīng)4%多聚甲醛固定后，0.3%Triton X-100室溫通透，正常血清封閉，滴加Nestin小鼠單克隆抗體，行ABC法免疫組織化學(xué)染色。染色后，以50%甘油封片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察照相。

2.3 神經(jīng)干細(xì)胞BrdU標(biāo)記及增殖鑒定

將NSCs亞代克隆細(xì)胞球制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)3 d后摻入BrdU（10 ?mol/L），24 h后吹散NSCs克隆球，收集細(xì)胞接種于預(yù)先置有50 ?g/mL-多聚賴氨酸涂層蓋玻片的6孔板中，貼壁生長(zhǎng)2 h。經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用鹽酸變性硼酸中和，然后以正常血清封閉。滴加單克隆Anti-BrdU抗體（1∶800），4 ℃過夜，行ABC法免疫組織化學(xué)染色，并以蘇木素復(fù)染，以50%甘油封片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察照相。

2.4 有限稀釋法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用

將NSCs克隆球制成1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液稀釋240倍，分別加入0.035 ?mol/L丹酚酸B和不同劑量的黃芪甲苷（6、0.6、0.06 ?mol/L），種入24孔板。共設(shè)5組（對(duì)照組、丹酚酸B組及黃芪甲苷高、中、低劑量組），每組4孔。常規(guī)培養(yǎng)4 d后對(duì)神經(jīng)球進(jìn)行計(jì)數(shù)（包含細(xì)胞≥5）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以―x±s表示，采用方差分析。P

4 結(jié)果

4.1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及增殖鑒定

對(duì)傳代NSCs進(jìn)行Nestin染色，細(xì)胞胞漿呈棕黃色，為陽(yáng)性（細(xì)胞陰性對(duì)照未黃染），表明本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)細(xì)胞為NSCs，見圖1。對(duì)傳代NSCs進(jìn)行BrdU標(biāo)記后染色，與BrdU陰性對(duì)照比較，NSCs細(xì)胞核被黃染，表明經(jīng)傳代后NSCs依然具有體外分裂增殖能力，見圖2。

4.2 不同劑量黃芪甲苷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響

第1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，黃芪甲苷高、中、低劑量組神經(jīng)球生成數(shù)目均顯著增加（P

5 討論

NSCs源于胚胎干細(xì)胞和成年干細(xì)胞，具有自我更新、多潛能分化、低免疫原性，以及具有遷移功能等生物學(xué)特征。正常情況下NSCs通常處于靜息狀態(tài)，僅表現(xiàn)較低的再生能力，在一定的病理刺激下被激活。在神經(jīng)退行性病變或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷的情況下，病變部位潛在的內(nèi)源性干細(xì)胞可被激活，進(jìn)行增殖、分化并取代死亡的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞[7]。利用NSCs治療神經(jīng)退行性病變以及修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷存在巨大潛力。目前對(duì)NSCs的研究，一是在體外分離培養(yǎng)NSCs，并移植入受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[8]；二是在體內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化而獲得自我修復(fù)[9-10]。由于具體的移植細(xì)胞的數(shù)量以及最佳的移植時(shí)間窗仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)由于倫理學(xué)等因素的影響而使供體來源受限，因此尋找藥物，尤其是天然植物藥對(duì)內(nèi)源性NSCs的增殖、分化的影響，將有巨大的價(jià)值。

Reynolds等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，可以通過NSCs形成神經(jīng)球的能力來反映NSCs的自我更新能力。并且，對(duì)于神經(jīng)球的培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，成為衡量NSCs自我更新能力的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究以無(wú)血清的培養(yǎng)基觀察黃芪甲苷對(duì)神經(jīng)球形成的影響。在添加EGF和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基中，分離得到的大鼠胚胎NSCs能夠增殖形成神經(jīng)球。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在含有不同濃度黃芪甲苷的藥物培養(yǎng)基中，神經(jīng)球的增殖水平有所提高。黃芪甲苷在0.06～6 ?mol/L的劑量范圍內(nèi)，培養(yǎng)板中神經(jīng)球的數(shù)目顯著增加。說明黃芪甲苷能夠顯著提高NSCs的增殖活性，并且有望在更低的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出促進(jìn)NSCs增殖的作用。

黃芪是常見的補(bǔ)氣中藥，有效成分主要有皂苷類、黃酮類及多糖等。曲氏等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液使大鼠組織神經(jīng)細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，抑制腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用。李氏等[14]研究表明，黃芪總苷和黃芪甲苷對(duì)氫化可地松誘導(dǎo)老前期大鼠衰老具有延緩作用。本研究結(jié)果表明，黃芪甲苷具有明顯的促進(jìn)NSCs增殖作用。今后將繼續(xù)對(duì)黃芪甲苷對(duì)大鼠胚胎NSCs增殖作用機(jī)制進(jìn)行深入探討和研究，為開發(fā)具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物提供依據(jù)。

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第9篇：黃芪的作用范文

關(guān)鍵詞：黃芪總皂苷；三七總皂苷；腦缺血再灌注；腦水腫；SOD活力；CAT活力；MDA

中圖分類號(hào)：R743；R-33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：

1673-7717（2008）11-2486-03

Effect of Astragalus and Pnanx Notoginsong on Cerebral Edema and

Lipid Peroxidation of Cerebral IIschemia Reperfusion of Animols

REN Zhouxin1, LI Li2, LI Jun2, LUO Yongming3（

1.Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008，Henan,China;

2. Henan Institute of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou450004，Henan,China;

3. Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004，Jiangxi,China

）

Abstract：Objective: To investigate the effect of total saponins of Astragalus(TSA) and total saponins of Pnanx notoginseng(PNS) on cerebral edema and lipid peroxidation in cerebral ischemia reperfusion of animals. Methods:Two common carotid arteries of rats or mice were ligated to make the model of cerebral ischemia reperfusion.Then drugs were given by vein.Many indexes were detected, including of water content of cerebrum, content of EB and MDA, activity of SOD,CAT in cerebral tissue.Results:Compared with vehicle group, CAT and SOD activities were increased significantly and MDA content, water content of cerebrum,content of EB were decreased significantly in TSA and PNS group(P

Key words：Astragalus;Pnanx notoginseng；cerebral ischemia reperfusion；lipid peroxidation；SOD activity；CAT activity；MDA

前期的研究發(fā)現(xiàn)：黃芪總皂苷合三七總皂苷配伍對(duì)缺血再灌注腦組織損傷具有協(xié)同的抑制作用，并找到了優(yōu)化配伍劑量[1]。本部分實(shí)驗(yàn)在多種腦缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型上觀察TSA＋PNS對(duì)腦組織水腫、腦血管的通透性和腦組織中SOD活力、CAT活力和MDA濃度的影響，首次對(duì)TSA＋PNS的藥效學(xué)進(jìn)行了初步的研究。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，清潔級(jí)，體重250～300g，昆明小鼠，清潔級(jí)，雄性，體重25～30g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2004-0007。

1.2藥物

黃芪總皂苷，從豆科植物蒙古黃芪Astragalosides membranaceus Burge.的干燥根中提取，為易吸濕的淡黃色粉末；三七總皂苷，從Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen.的干燥根中提取，為淡黃色粉末，江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系提供。經(jīng)過純化驗(yàn)證和HPLC圖譜分析，三七和黃芪總皂苷的純度分別達(dá)到了87.5%和74.0%。尼立蘇注射液（有效成分尼莫地平），山東新華制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：0402006。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

723-A型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴箱,北京市醫(yī)療設(shè)備總廠產(chǎn)品；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)，江蘇金壇宏華儀器廠產(chǎn)品。SOD、CAT、MDA測(cè)試盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。伊文思藍(lán)，F(xiàn)luka進(jìn)口分裝。

2方法

2.1對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠腦水腫腦血管通透性的影響

2.1.1分組模型制作和給藥共分成6組，假手術(shù)組、模型組、尼莫地平1mg/kg組、TSA8mg/kg+PNS20mg/kg組、TSA16mg/kg+PNS40mg/kg組、TSA32mg/kg+PNS80mg/kg組。水合氯醛ip麻醉大鼠，頸正中切口，暴露并分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，用小動(dòng)脈夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，用溫生理鹽水濕潤(rùn)紗布，輕輕覆蓋創(chuàng)口，避免手術(shù)窗口干燥。模型組和各給藥組在接扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈前5min，由股靜脈注射伊文思藍(lán)50mg/kg。缺血90min后，舌下靜脈注射藥物或等容量的生理鹽水，打開動(dòng)脈夾再灌注，直視下證實(shí)血流恢復(fù)了再通，剔除不能恢復(fù)血流的動(dòng)物?？p合手術(shù)創(chuàng)口。假手術(shù)組動(dòng)物不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，其余操作同上。測(cè)量腦含水量的動(dòng)物不注射伊文思藍(lán)，其余操作同上。

2.1.2腦含水量和腦指數(shù)測(cè)定再灌注1h后，斷頭，在冰浴上取腦，無(wú)菌條件下用4℃生理鹽水漂洗，去除血跡，用濾紙吸干表面水分，稱重后在106℃烘箱中烘48h至衡重，計(jì)算腦含水量：腦含水量＝（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%。

2.1.3腦組織中伊文思藍(lán)含量的測(cè)定再灌注1h后，斷頭，在冰浴上取腦，無(wú)菌條件下用4℃生理鹽水漂洗，去處血跡，用濾紙吸干表面水分，稱重，浸泡于5mL甲酰胺溶液中，在45℃條件下溫浴72h，取色素液比色，根據(jù)回歸方程計(jì)算伊文思藍(lán)的含量，以μg/g濕重表示。

2.2對(duì)腦缺血再灌注模型小鼠腦組織中脂質(zhì)過氧化的影響

2.2.1分組模型制作和給藥共分成6組，假手術(shù)組、模型組、尼莫地平2mg/kg組、TSA16mg/kg+PNS40mg/kg組、TSA32mg/kg+PNS80mg/kg組、TSA64mg/kg+PNS160mg/kg組。水合氯醛ip麻醉小鼠，頸正中切口，暴露并分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，用小動(dòng)脈夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15min，打開動(dòng)脈夾，再灌注10min，再次關(guān)閉15min，同時(shí)，股靜脈取血0.4mL，立即尾靜脈注射藥物，再灌注后12、18、24h，迅速斷頭，在冰浴上取腦，無(wú)菌條件下用4℃生理鹽水漂洗，去除血跡，然后去處小腦和嗅球，制作組織勻漿。假手術(shù)組動(dòng)物不夾閉雙側(cè)頸縱動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，不取血，其余操作同上。

2.2.2腦組織中SOD CAT MDA檢測(cè)取不同濃度的組織勻漿，按照試劑盒說明書操作，分別檢測(cè)SOD活力、CAT活力、MDA含量。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS11.5軟件做統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較用單因素方差分析Student-Newman-Keleus test統(tǒng)計(jì)。

3結(jié)果

3.1對(duì)腦組織含水量和血腦通透性的影響

結(jié)果見表1。和假手術(shù)組比較，模型組腦含水量顯著增加（P

3.2對(duì)腦組織中T-SOD活力 CAT活力和MDA含量的影響

結(jié)果見圖1～3。和假手術(shù)組比較，手術(shù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組腦組織勻漿中T-SOD活力顯著降低（P

4 討 論

腦水腫的發(fā)生和血腦屏障（BBB）的破壞密切相關(guān)。正常生理狀態(tài)下，伊文思藍(lán)（EB）進(jìn)入血中與血漿蛋白緊密結(jié)合，不易透過BBB。BBB損傷后，結(jié)合EB的血漿蛋白可外滲入腦組織，使腦組織中的EB含量增加，所以，腦組織中EB的含量能夠反映BBB的通透性。BBB是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、外膜細(xì)胞、血管周圍的巨噬細(xì)胞和基底膜組成。它能控制血循環(huán)中許多物質(zhì)向中樞神經(jīng)組織的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而保證中樞神經(jīng)組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腦缺血再灌注后，血管局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞的黏附、活化，釋放出的蛋白水解酶等破壞了BBB，血液中的糖類等多種成分大量進(jìn)入腦組織，導(dǎo)致腦水腫。本研究結(jié)果證實(shí)：TSA＋PNS能降低腦缺血再灌注大鼠腦組織中的EB含量，降低腦微血管的通透性；降低腦組織的含水量，抑制腦水腫。

一些實(shí)驗(yàn)顯示：腦缺血再灌注的水腫和自由基密切相關(guān)[2]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈接扎再灌注模型是一個(gè)比較成熟的模型，能較好地再現(xiàn)自由基的產(chǎn)生，對(duì)組織的破壞，以及清除自由基酶活力的變化等病理過程。用體外自旋捕捉和低溫ESR法都可以測(cè)得該種模型OFR信號(hào)顯著增強(qiáng)[3]，用高效液相的方法，證實(shí)•OH含量顯著增高[4]。

在本次實(shí)驗(yàn)中，模型組和假手術(shù)組比較，T-SOD活力、CAT活力和MDA濃度均呈現(xiàn)顯著性差異，從再灌注12～24h時(shí)程上看：模型組代表細(xì)胞膜受損程度的MDA濃度逐漸降低，提示該段時(shí)間自由基的致?lián)p作用逐漸減輕，T-SOD活力、CAT活力在18h最低，而在24h又有所回升。這些結(jié)果提示：缺血再灌注對(duì)腦組織自由基清除系統(tǒng)的影響是多方面的，一方面，大量出現(xiàn)的自由基產(chǎn)生的過量消耗，是自由基清除酶活力降低的主要原因；另一方面，這種消耗可能通過某種機(jī)制，激活了機(jī)體自由基清除系統(tǒng)的代償機(jī)制，大量表達(dá)具有清除自由基的酶蛋白，以補(bǔ)充這種消耗。

文獻(xiàn)報(bào)道：TSA可以從多種途徑對(duì)抗自由基，減輕腦損傷。體外用Xan/XO魯米諾CCl體系中加入TSA，能夠抑制O-2和發(fā)光劑魯米諾反應(yīng)，釋放出光子，證實(shí)TSA具有清除O-2的作用[5]。組織中SOD是重要的O-2清除劑，先給予黃芪甲苷，能夠抑制小鼠局灶性腦缺血組織中SOD活性的降低，提高SOD的催化能力，可能是黃芪皂苷清除O-2的重要機(jī)制[6]。另有報(bào)道：TSA對(duì)•OH也有顯著的清除作用[7]。PNS對(duì)黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的自由基有清除作用[7]，能通過保護(hù)內(nèi)源性SOD活性和抑制脂質(zhì)過氧化的抗氧自由基機(jī)制，減輕腦缺血再灌注損傷[8]。在本次實(shí)驗(yàn)中，TSA＋PNS中、高劑量應(yīng)用后，可提高T-SOD活力，降低MDA含量，中劑量提高CAT活力，提示TSA＋PNS具有抗氧化損傷的作用，該作用可能和提高病理狀態(tài)下的SOD、CAT活力有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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［3］ 陳志武,馬傳庚.缺血性腦損傷與鈣離子、氧自由基及一氧化氮的關(guān)系[J].中國(guó)藥學(xué)雜志, 2002,37(11):803.

［4］ Cao W, Carney JM, Duchon A, et al. Oxygen free radical involvement in ischemia and reperfusion injury to brain[J]. Neurosic Lett, 1980, 88(2): 233.

［5］ 汪德清,沈文梅,田亞平,等.黃芪的三種提取成分對(duì)氧自由基作用的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 1994, 10(2):129.

［6］ 羅玉敏,秦震.黃芪甲苷對(duì)局灶性腦缺血小鼠腦組織超氧化物歧化酶的影響[J].中華神經(jīng)科雜志, 1999, 32(1):47.