正向遺傳學克隆基因的方法精選(九篇)

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第1篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

目前世界上。在應用高新技術(shù)的生物工程上開展了劇烈的競爭，誰先掌握到最新資源、最高技術(shù)和最優(yōu)品種的成果，就有可能壟斷一定的市場。在農(nóng)林業(yè)方面，競爭的焦點主要集中在種子上。有科學家預言。在這場“種子戰(zhàn)爭”中?；蛟S可以利用一種資源、一個品種而在種子戰(zhàn)爭中稱雄于世；進而指出.一個基因就有可能影響到一個國家或地區(qū)的興衰。但我國在林木種子新技術(shù)革命上，起步較晚，基礎比較薄弱，應該加強這方面的研究，期望在林木種子革命中有所突破。為林業(yè)現(xiàn)代化作出新貢獻。

1 林木種子革命的背景和意義

70年代以來，世界上提出“綠色革命”的口號，其實質(zhì)是指種子革命。應該說綠色革命首先是從農(nóng)業(yè)開始的。世界人口的爆炸帶來糧食的緊缺，建設的需要使耕地越來越少，迫使人們必須加快研究選育和推廣應用優(yōu)良的農(nóng)作物新品種，及其配套改革栽培管理技術(shù)。使作物單位面積的產(chǎn)量越來越高，以解決人類的吃飯問題。隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，資源短缺以及環(huán)境惡化的矛盾日益突出，世界的生態(tài)平衡受到破壞，人類的生存受到威脅。此時，人們不僅要考慮吃飯問題，還要考慮生存及可持續(xù)發(fā)展等問題。因此“綠色革命”從農(nóng)業(yè)延伸到林業(yè)等學科。

森林是地球上生態(tài)系統(tǒng)中最重要的因素。人們對森林的認識已從單純索取木材轉(zhuǎn)變到可持續(xù)經(jīng)營的角度上來，提出分類經(jīng)營思想，即把森林區(qū)分為生態(tài)林與商品林來經(jīng)營。用80％～90％的林地建設生態(tài)林，采用復層林作業(yè)，其主要作用是保護生態(tài)環(huán)境；把條件較好的10％～20％的林地用于商品林建設，進行高度集約經(jīng)營，主要用于向人們提供木材等林產(chǎn)品。例如。新西蘭的商品林僅占其森林總面積的8％.但提供木材占其總產(chǎn)量的90％以上。其關鍵的技術(shù)是林木種子的革命。我們用“革命”這個字眼。是因為良種對林業(yè)生產(chǎn)力起著決定性作用，它的變革是根本性的，可帶來翻翻的產(chǎn)量。是現(xiàn)代林業(yè)的一個核心技術(shù)。

國內(nèi)外通過林木種子改良取得明顯效益的事例，不勝枚舉。桉樹原產(chǎn)澳大利亞等地，引進巴西后，經(jīng)過改良，采用無性系營造商品林，5年生時，樹高可達25m，7～8年即可砍伐更新，每公頃蓄積量超過600m3。剛果進行的桉樹育種計劃取得的遺傳增益為：種源選擇50％-80％ ；雜交、個體選擇、無性系增益100％～150％。

以上事例可以說明，林木良種化帶來的效益是十分明顯的。林木與農(nóng)作物有所不同，樹木多為異花授粉，多數(shù)處于野生或半野生狀態(tài)，大部分林木是未經(jīng)過改良的原始材料。它們的變異普遍，變異的性狀多、幅度大，蘊藏著大量尚未利用的優(yōu)良變異類型。這些優(yōu)良類型一旦被選育出來，就可以顯著地提高林業(yè)的生產(chǎn)力，加上多數(shù)林木具有容易進行基因型“克隆”的特性，一經(jīng)選擇，馬上采用無性繁殖，大量復制，就可很快投入到林業(yè)生產(chǎn)實踐中。

林業(yè)上選育良種與農(nóng)業(yè)比較，具有更加經(jīng)濟長效的優(yōu)點，在生產(chǎn)周期中只需采用一次，即能獲得長久的效果。農(nóng)業(yè)上一個品種不行，第二年甚至第二季就可換一個。而林木生長周期長，一粒種子播下后，十幾年或幾十年才能砍伐，如果選用良種，年年可獲取增益。從這個意義上看，林木良種選育具有更為迫切的意義。

2 林木品種改良的途徑

2.1 林木遺傳改良的一般過程

林木遺傳改良的形式多種多樣，可以用如下圖式表達其一般過程：

(1)基本群體表型選擇優(yōu)良類型

(2)優(yōu)良類型遺傳測定原種

(3)原種良種繁育品種

(4)品種區(qū)域化測定良種

可見一個新品種的培育過程經(jīng)歷了選擇——測定——繁育——推廣等過程，極為精細復雜，需要耗費大量的時間和經(jīng)費。

2.2 種質(zhì)資源開發(fā)利用

樹木基因資源是地球人的寶貴財富，也是選育樹木優(yōu)良品種的物質(zhì)基礎。不論是常規(guī)育種，還是誘變育種乃至遺傳工程研究，都離不開基因資源。實踐證明，搜集的基因資源越豐富、越全面，對它們研究得越深入、越有針對性，就越能滿足各種育種目標的要求，選育出人們所期望的新品種。同時，基因資源不僅用于當前的育種，而且要為將來培育更高質(zhì)量的新品種服務。

據(jù)分類學家估計，全世界現(xiàn)有植物5O多萬種，高等植物23萬多種。經(jīng)人類長期馴化栽培，提供人類吃、穿、用等方面的植物種類，只不過1％～2％。約有2000多種。常見栽培作物只有175種，其中16種提供了人類食物的2／3。正是這些為數(shù)不多的栽培種類，成為人類社會物質(zhì)文明的重要基礎。譬如樹木中的三倍體山楊、直干藍桉等都是從野生林分中發(fā)現(xiàn)的快速生長的優(yōu)良單株。因此，從某種意義上講，基因資源的收集和保存比創(chuàng)造新品種更為重要，是一項具有戰(zhàn)略意義的工作 。

2.3 選擇育種

選擇育種是獲得優(yōu)良品種和生產(chǎn)群體的重要手段，在林木改良中具有極其重要的意義。選擇育種可以在較短時間內(nèi)，得到人們需要的基因型，經(jīng)過繁育馬上就可投入到生產(chǎn)之中。例如筆者在天然馬尾松林中發(fā)現(xiàn)紅心率達8O％以上的馬尾松單株，這類馬尾松1996年的價格是3000元／m3，為普通馬尾松的5倍。

選擇的物質(zhì)基礎是所研究材料的變異，材料的變異越大，變異越豐富，選擇的效果越好。以往林業(yè)上多用天然變異，從野生樹木中，篩選符合人們愿望的類型，通過培育為新品種。這種利用天然變異材料仍不失為林木選育新品種的有效途徑。但天然變異畢竟有它的局限性，難于滿足社會發(fā)展的需求。于是人們又創(chuàng)造了人工的變異方法，以擴大變異范圍和增加選擇機會，成為直接改良品種的有力手段。如19世紀已開始的樹木雜交育種，通過不同種質(zhì)問的有性雜交，使父本母本的基因進行交換重組，產(chǎn)生變異。這種方法不僅可以使雜交親本雙方的性狀互補，取長補短。而且可能出現(xiàn)超過親本的性狀，產(chǎn)生原來親本所沒有表現(xiàn)出來的新性狀?，F(xiàn)已從種內(nèi)雜交發(fā)展到種間雜交。進入2O世紀以來，人工促進遺傳變異的技術(shù)得到很大的發(fā)展。7O年代以前主要用物理和化學因素來誘發(fā)植物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生變異.使基因突變的頻率比自然界自發(fā)突變高出100～1000倍。但這種誘變的方向和性質(zhì)不易控制，選種的效率較低，因此進展不快。6O年代以來.植物的生物技術(shù)發(fā)展得很快，從器官培養(yǎng)到細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細胞雜交等，直到現(xiàn)在的細胞工程、染色體工程、基因工程，新技術(shù)、新成果不斷涌現(xiàn)，給林業(yè)帶來革命性的變化。

2.4 遺傳測定

在目前樹木育種工作中，處理的育種材料多數(shù)屬于未經(jīng)遺傳鑒定的表現(xiàn)型。表現(xiàn)型是樹木遺傳性與環(huán)境條件相互作用的結(jié)果.所以優(yōu)良的表現(xiàn)型并不等于它的遺傳性優(yōu)良。只有經(jīng)過遺傳測定，認定優(yōu)良的經(jīng)濟性狀受遺傳控制，從屬于優(yōu)良的遺傳性，才能作為原種，進入到更高一級的育種階段。

2.5 林木良種繁育

良種繁育是林木良種化中重要的環(huán)節(jié)之一。當通過表型測定選育出來的品種.經(jīng)過區(qū)域化試驗，確定推廣地區(qū)后，便要做好良種的繁育工作，直至該品種被更換了為止。良種繁育是育種工作的繼續(xù)，是前承育種后接推廣并不斷提高種性的一個重要環(huán)節(jié)。如果繁育措施不當.使良種變?yōu)榱臃N，就會失去它的增產(chǎn)效益。良種繁育不僅是前一輪育種成果進入生產(chǎn)的唯一手段，而且也是下一輪育種所需要的遺傳信息和基礎材料獲得的來源。

目前林木良種主要采用有性和無性兩種形式進行繁育。營建無性系種子園是有性繁育的主要方式，它的營建技術(shù)較簡單，繁殖系數(shù)較大，被廣泛采用。其實質(zhì)是通過選擇.改良原有群體的基因的頻率，提高其正向選擇的遺傳增益，達到改良的目的。目前種子園主要的問題是產(chǎn)量低，實生種子的遺傳基礎不一致，對高度集約的商品林來說，木材以及林產(chǎn)品的不一致性，給利用帶來困難。在無性繁殖的情況下，無性系分株的遺傳成分與其原株的完全相同，它們不僅繼承了原株的加性效應，而且繼承了原株的顯性和上位作用效應。所以在選擇差相同的情況下，能取得較大的遺傳增益，因此近代國內(nèi)外都趨向于無性系育種和無性系林業(yè)。

總之，林木種子從原來的見種就采、見苗就種的局面，到現(xiàn)在選擇優(yōu)良種源、優(yōu)良林分、優(yōu)良家系、優(yōu)良無性系，建立種子園與采穗圃生產(chǎn)良種，已經(jīng)大大地向前邁進了一步。它已發(fā)揮出明顯的作用，產(chǎn)生了巨大的效益。從某種意義上說，已經(jīng)開始了林木種子的革命。但這還不夠，現(xiàn)代科技的發(fā)展，還要求我們加快生物技術(shù)應用的步伐，開展更深層次的林木種子新技術(shù)革命。

3 生物技術(shù)與林木種子革命

近年來生物技術(shù)發(fā)展迅速.它包括細胞工程、染色體工程和基因工程。

3.1 細胞工程

細胞工程主要包括原生質(zhì)體培養(yǎng)、大規(guī)模的工廠化的細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和快速繁殖等技術(shù)，以生產(chǎn)大量的優(yōu)良無性系，并可獲得人類所需要的多種代謝物質(zhì)，如黃連素、人參皂甙等。細胞融合，它可打破種屬間的界限，在樹木新品種的培育上有著巨大的潛力。目前，胚胎分化人工種子等技術(shù)的利用也日益普及。

3.1.1 林木的組織培養(yǎng)

樹木組織和細胞培養(yǎng)的研究也取得了重要的進展。目前由體細胞再生出完整植株的有：歐洲樺、檸檬桉、巨桉、楊樹、花旗松、長葉松、杉木、柳杉等幾十種樹種。林木原生質(zhì)體培養(yǎng)及細胞雜交也進行了探索，歐洲云杉、花旗松、火炬松、短葉松、楊樹、泡桐等樹種已分離出原生質(zhì)體，并進行了培養(yǎng)。日本對楊樹種和泡桐的原生質(zhì)體做了融合試驗。

用組織培養(yǎng)繁殖樹木，不僅和無性繁殖一樣，能保持樹木的優(yōu)良性狀，同時還具有如下特點：(1)繁殖系數(shù)大；(2)縮短良種的推廣周期；(3)培養(yǎng)無菌苗；(4)繁殖難于用常規(guī)方法營養(yǎng)繁殖的樹種；(5)發(fā)育階段返青；(6)可作用保有基因資源的一種手段；(7)變異培養(yǎng)無性系利用啕。

3.1.2 胚胎發(fā)生及人工種子

器官與胚胎發(fā)生是培養(yǎng)植物細胞分化的兩種主要途徑。用胚狀體形成植株主要特點是增殖迅速、遺傳單一。在組培中獲得胚狀體以后用適當方法加以包裹即可制成人工種子。根據(jù)Flick和Ammirato(1983)統(tǒng)計，經(jīng)胚胎發(fā)生途徑得到完整植株的植物有91種。其中有火炬松、糖松和挪威云杉獲得體細胞胚胎及小苗。我國培育成功的樹木體細胞胚胎發(fā)生及小苗形成是中國科學院于1988年以華北云杉(Picea wilsomii)為試材研究成功的。人工種子研制的關鍵是選擇適當?shù)姆绞竭M行包被.最常見的是凝膠法包裹。隨著人工種子研究的深入.將有愈來愈多的人工種皮材料被開發(fā)出來。

3.1.3 原生質(zhì)體培養(yǎng)

自從Cocking在1960年用纖維素分解植物細胞壁首獲原生質(zhì)體以來，在原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合方面已取得突破性進展。國內(nèi)外約有2O種林木獲得原生質(zhì)體，其中一部分已誘導成植株。

3.1.4 體細胞融合

體細胞融合試驗應在誘導原生質(zhì)體再生植株的基礎上進行。體細胞融合方法對于樹木改良特別適合.該法與常規(guī)有性雜交比較，具備以下特點：(1)能形成兩個親緣關系較遠的種間雜種，克服了有性雜交的配子不親合性；(2)能獲得一些含有另一親本非整倍體的雜種或胞質(zhì)雜種；(3)能設計出一次兩個以上親本的融合；(4)能獲得在遺傳上呈雙親個體基因型總和的雜種；(5)能獲得一些有性生殖障礙的植物種類的體細胞雜種；(6)能獲得具有不同遺傳變化親本的雜種。

3.2 染色體技術(shù)

染色體技術(shù)在樹木的核型、組型、帶型分析的基礎性研究較為深入。速生豐產(chǎn)樹種杉木、楊樹、馬尾松等既有常規(guī)的細胞學研究，也有地理種源的染色體性狀比較。經(jīng)濟林樹種山茶、油茶、漆樹、桑樹、獼猴挑等染色體研究資料也較為深入，藥用植物杜仲、銀杏等有一定的研究。染色體研究在科以上的有杉科、松科、芍藥科、銀杏、山茶科等；地域性染色體資源研究有云南、廣西、寧夏、貴州等地。這些基礎性研究為保護植物種質(zhì)資源，研究樹種的分類、分化、系統(tǒng)發(fā)育提供了詳實的細胞學材料。

3.3 基因工程

樹木基因工程取得的進展及其作用主要有：

3.3.1 DNA分離與轉(zhuǎn)導

基因工程的一個最關鍵技術(shù)是把目的基因轉(zhuǎn)導到目標植物中去，并使其能準確地表達出來。8O年代初.人類首次從細菌中分離出來一些分解抗生素的基因，成功地轉(zhuǎn)移到植物細胞中，并獲得能在含抗生素的培養(yǎng)基上生長的植株。此后即出現(xiàn)了一系列轉(zhuǎn)基因植株。同時轉(zhuǎn)基因技術(shù)也日益成熟。目前林木轉(zhuǎn)基因技術(shù)有不少成功的事例：

(1)抗蟲轉(zhuǎn)基因植株。1988年美國依阿華大學林學系利用從馬鈴薯中提取的蛋白酶抑制劑Ⅱ號(InhibitorⅡ)為目的基因，與以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NoemycinphosphotransteraseⅡ，即N Ⅱ)為標記基因制成嵌合基因，以根癌農(nóng)桿菌 grobacteriumtumefeciens)的Ti質(zhì)粒為載體，以葉盤轉(zhuǎn)化再生法(Leaf disk transf~lrmation regeneration me山ed)為組培手段，用楊樹雜種無性系(Popuius albaxPopulus grandidentata)為試材，經(jīng)測定這種抗蟲的轉(zhuǎn)基因植株具有高毒性，幼蟲取食后死亡率很高。

(2)抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。1987年美國加州和威斯康星州的科學家利用楊樹雜種無性系(alba.xP.grandidentata)為試材，從土壤中沙門氏細菌(Salmenella bacteria)提取抗除草劑的DNA.這種基因能控制一種特殊的酶，它能解除除草劑的作用，而對沙門氏菌安全。經(jīng)培養(yǎng)獲得除草劑轉(zhuǎn)基因植株。

(3)通過基因操作控制木素的生物合成。在生產(chǎn)紙槳的過程中，為除去不需要的木素需要大量的能源，處理木素廢液還要龐大的設備，于是就產(chǎn)生了培育木素含量少或易提取木素林木的想法。有人用“反意法”研究培育木素含量少的林木。另一項試驗是把合成闊葉樹型木素的基因?qū)脶樔~樹，培育含有大量易提取木素結(jié)構(gòu)的林木。

(4)抗大氣污染氣體的林木的培育。其重點在活性氧解毒上起重要作用的谷胱甘肽還原酶的基因上。有報告指出，把出自大腸桿菌的基因?qū)腚s種楊，培育提高此種酶活性的轉(zhuǎn)化體。在一般情況下，林木對大氣污染物質(zhì)也有很強的吸收和解毒能力。而此種酶活性進一步提高的轉(zhuǎn)化體，作環(huán)境綠化木是大有可能的，它具有很強的耐SO：和臭氧的性質(zhì)。

(5)控制林木形態(tài)的形成。對控制柳杉花形態(tài)形成的基因和變應原基因進行了分離.利用這些基因培育出能控制產(chǎn)生雄花和合成變應原的柳杉。有報告說：把白葶藶的控制芽分化的基因?qū)腚s種楊，得到了花芽形成時間由通常的8年縮短到僅7個月的轉(zhuǎn)化體。

(6)通過基因操作擴大林木的生育范圍。一般來說，植物生長發(fā)育的場所是不能變動的，個體或種的維持是靠與光照條件、大氣成分、土壤水分、土壤養(yǎng)分、有害物質(zhì)的吸收、病原菌的感染等環(huán)境條件相應的復雜的適應機制。例如，若能對平時出現(xiàn)過剩的基因進行操作。這種基因是控制耐干燥、耐鹽基因群的基因，那么，影響出現(xiàn)前轉(zhuǎn)化體就有防御機制，其結(jié)果就擴大了生長范圍。如果耐凍性、耐寒性、耐高溫性、抗紫外線性等受到重視，那么控制林木生長范圍(南限和北限、海拔高度界限等)的基因操作就會成功。

3.3.2 林木遺傳圖譜的構(gòu)建

遺傳圖譜是選用合適的自然群體或通過人工技術(shù)手段構(gòu)建的人工作圖群體，利用各類遺傳標記和定位的基因構(gòu)建的遺傳標記與基因的線性排列圖。林木遺傳圖譜是對林木基因組進行系統(tǒng)研究的基礎。由于林木生育周期長，利用形態(tài)標記來構(gòu)建遺傳圖譜幾乎不可能，所以過去幾乎找不到林木遺傳圖譜。由于同工酶技術(shù)的發(fā)展，7O-8O年代構(gòu)建了一部分樹種的同工酶標記的遺傳圖譜。但同工酶利用的標記有限。難以構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。由于分子標記的開發(fā)，近年林木遺傳圖譜構(gòu)建已成為林木遺傳學研究的熱點，有利于在短期內(nèi)構(gòu)建高密度的圖譜。共顯性以分子標記如RFLP、SSR、STS等適合于任何作物群體的遺傳作圖；而顯性標記如RAPD只適合于單株針葉樹構(gòu)成的群體(因其來自親本的單倍體胚乳)和DH群體。利用大量分子標記構(gòu)筑高密度連鎖圖后，有利于今后未知基因的定位、克隆及分子標記輔助選擇等。

3.3.3 目標基因定位和克隆

利用已有的遺傳圖譜及適當?shù)姆蛛x群體可以將目標基因或數(shù)量性狀座位(Quantitative TraitLoci。簡稱QTL)定位于某條染色體的某一區(qū)段或每兩個遺傳標記之間。這些被定位的主基因或QTL可利用位置克隆的辦法被分離克隆，一些作物的有用基因如水稻白葉枯病抗性基因Xa2 ，就是這樣被克隆到的。

數(shù)量遺傳學作為遺傳學的一個分支一直是獨立發(fā)展的。但到8O年代卻處于低谷。由于分子生物學的崛起，分子標記的開發(fā)，數(shù)量遺傳和分子生物學的結(jié)合產(chǎn)生了新的邊緣學科——分子數(shù)量遺傳學，使得數(shù)量遺傳學重新獲得新生。因為利用分子標記對QTL的定位，可象一般主基因那樣將QTL克隆出來加以利用。這對林木遺傳育種將產(chǎn)生重大影響。因為許多經(jīng)濟性狀都是由QTL控制的。

3.3.4 分子標記輔助選擇育種

分子標記輔助選擇(Maker Assisted Selec—tion。簡稱MAS)。是通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記的基因型來判斷目標基因是否存在的一種植物育種選擇方法。這種方法不受其它基因效應和環(huán)境因素的影響，因此結(jié)果較可靠，而且可以進行早期選擇和對隱性基因的選擇，從而大大加快育種進程。提高選擇效果。特別對于生育周期長的林木來說更具有重要意義。

3.3.5 物種、品種及優(yōu)良無性系鑒別

不同物種、品種及單株在基因組上均存在差異，不同植株(不同無性系)之間的差異在多數(shù)情況下是難以鑒別出來的。但由于分子標記的無限性，總可以將其區(qū)分開來。因此分子標記可非常有效地用于林木育種特別是優(yōu)良無性系的鑒別，還可用于物種、品種分類。利用分子標記可以檢測出林木種子園外來其它花粉的污染情況，也可鑒定其生產(chǎn)的種子是否真由種子園親本之間雜交產(chǎn)生，以檢測種子的混雜性。

3.3.6 在林木基因研究上的應用

林木的生理現(xiàn)象還有很多是未知的，用基因結(jié)構(gòu)和機能加以說明是驗證科學世界的要求。例如把控制形態(tài)形成的基因?qū)脬@天楊并出現(xiàn)過剩。那么就會改變?nèi)~的形態(tài)，或者節(jié)間變短或者短化。因此我們認為，這種基因有調(diào)節(jié)葉的形態(tài)、節(jié)間長短和樹高的可能性?？傊?，基因操作可稱作是解析未知的基因機能的重要技術(shù)。林木研究方面也在尋求開發(fā)組織特異的或生長階段特異的促進劑。我們在世界上率先對與裸子植物光合作用有關的基因的促進劑結(jié)構(gòu)與機能進行了解析。分析基因促進劑時。要求在促進劑范圍內(nèi)讓信使基因連結(jié)。向基因分離了的該生物種類基因轉(zhuǎn)移，通過信使基因的出現(xiàn)，分析促進劑的機能。

3.3.7 在林木染色體組研究上的應用

對人及實驗動植物的染色體組研究正在蓬勃開展。為了推進林木的染色體組研究，用DNA限制酶斷片多型分析，成功地編制了柳杉連鎖圖。對部分連鎖群來說。利用三體生物能使其處于與特定染色體相對應的狀態(tài)。該連鎖圖將向未來高密度連鎖圖發(fā)展。與11條染色體的對應及染色體上的基因配置也能得到理解，作為有關柳杉染色體組的結(jié)構(gòu)與機能的基礎信息將會起重要作用。

第2篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

摘要:

種質(zhì)資源又稱遺傳資源，其不僅是進行農(nóng)業(yè)科技原始創(chuàng)新以及現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎，更是保障糧食安全、建設生態(tài)文明并實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性資源。本文從種質(zhì)資源的收集、鑒定和評價、創(chuàng)制及利用等方面進行了綜述，以期為分子育種時代的種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用工作提供可利用的信息。

關鍵詞:

分子育種;種質(zhì)資源;創(chuàng)新;利用

種質(zhì)資源又稱遺傳資源，是進行新品種選育的基礎材料。古老的地方品種、重要的遺傳材料、野生近緣植物以及利用上述繁殖材料人工創(chuàng)造的各種植物的遺傳材料，都屬于種質(zhì)資源的范疇。就作物而言，種質(zhì)資源不僅是進行農(nóng)業(yè)科技原始創(chuàng)新以及現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎，更是保障糧食安全、建設生態(tài)文明、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性資源。種質(zhì)資源的核心是其所攜帶的基因，對優(yōu)異基因進行挖掘和充分利用可使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)取得突破性進展，舉世聞名的第一次“綠色革命”就源于小麥和水稻中矮稈基因的發(fā)現(xiàn)和應用［1］。長期以來，我國作物種質(zhì)資源工作的重點一直停留在收集、保存與鑒定等方面，導致具有廣泛應用前景的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、高效等關鍵功能基因的發(fā)掘與利用滯后，突破性新種質(zhì)匱乏以及特有基因資源流失嚴重等問題。根據(jù)《國家中長期科學和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要》精神，從國家科技發(fā)展總體布局出發(fā)，結(jié)合經(jīng)濟發(fā)展和國家安全需求，在現(xiàn)代生物技術(shù)高速發(fā)展的時代背景下，作物種質(zhì)資源的工作重心將轉(zhuǎn)向其優(yōu)異基因資源發(fā)掘與種質(zhì)創(chuàng)新，包括高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗生物及非生物逆境、水肥高效利用等基因資源，在明確其功能和應用價值的基礎上，創(chuàng)造一批可直接用于育種的中間材料。最新公布的七大作物育種專項也將優(yōu)異種質(zhì)資源鑒定與利用作為各項工作的重中之重。本文對我國種質(zhì)資源的收集、鑒定和評價、創(chuàng)制及利用現(xiàn)狀等方面進行了綜述，以期為作物種質(zhì)資源的創(chuàng)新和利用工作提供可利用的信息。

1種質(zhì)資源的收集

種質(zhì)資源的收集是一個很古老的話題。作為作物種質(zhì)資源大國，長期以來，我國政府和科學家也一直非常重視作物種質(zhì)資源的收集工作。自20世紀50年代以來，不僅先后組織了多次農(nóng)作物種質(zhì)資源征集和考察工作，而且在保存設施建設方面也加大了投入，挽救了一大批瀕臨滅絕的地方品種和野生近緣種及其特色資源，建立了完善的種質(zhì)資源保護體系［2］。2015年，農(nóng)業(yè)部、發(fā)展改革委和科技部聯(lián)合印發(fā)了關于《全國農(nóng)作物種質(zhì)資源保護與利用中長期發(fā)展規(guī)劃(2015—2030年)》的通知，深入分析了在現(xiàn)代農(nóng)作物種業(yè)發(fā)展過程中我國目前農(nóng)作物種質(zhì)資源保護與利用工作存在的問題，嚴密部署了第3次全國農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動，并就實施過程提出了詳細的技術(shù)規(guī)范。

2種質(zhì)資源的鑒定與評價

目前我國編入全國作物種質(zhì)資源目錄的材料約48萬余份，躍居世界第2位［3］。如何對數(shù)以萬計的種質(zhì)資源進行精準評價，從中發(fā)掘出優(yōu)異基因并將其應用于現(xiàn)代化育種工作，是現(xiàn)階段我國進行種質(zhì)資源收集的最主要的目標之一，也是亟待解決的科學問題之一。在對種質(zhì)資源進行廣泛收集和考察的基礎上，我國相關研究人員也對所保存的資源進行了基本農(nóng)藝性狀的鑒定，并進行了綜合評價。而這些基于不同年份、不同地點的調(diào)查所進行的評價，由于以易受環(huán)境影響的表型特征為依據(jù)，同時受研究條件和研究方法的制約，不能全方位、多層次地展開，因此精度有限。與表型鑒定相比，基于DNA序列多態(tài)性的分子標記則能在DNA水平上揭示種質(zhì)間的不同，不受環(huán)境及發(fā)育時期等因素影響，而且具有較高的穩(wěn)定性和可重復性，從而成為進行種質(zhì)資源的鑒定和評價的一個更直接、高效且可信的工具?，F(xiàn)階段，我們應重點基于分子標記進行種質(zhì)資源的DNA指紋分析、遺傳多樣性分析、核心種質(zhì)構(gòu)建以及功能基因的鑒定和評價等。

2.1DNA指紋分析

DNA指紋分析是分析并比較任何生物體之間DNA序列的非?？焖俚姆椒?，該方法已被廣泛且有效地用于種質(zhì)資源的管理。目前，用于指紋識別的分子標記有簡單重復序列或微衛(wèi)星、SCoT、抗性基因同源序列、SNP等多種類型。這些分子標記大多為單位點，符合孟德爾遺傳規(guī)律，而且多態(tài)性高、信息量豐富。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，基于高通量測序的基因型檢測方法也逐漸成為研究熱點之一。

2.2遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物多樣性的核心問題，是種質(zhì)資源研究的重要方向。物種內(nèi)或物種間的遺傳多樣性可以表現(xiàn)在多個層次上，如分子、細胞和個體等，遺傳多樣性是物種保持進化潛能的基本條件。近年來，遺傳多樣性的研究發(fā)展迅速，新的理論和方法不斷產(chǎn)生、發(fā)展和完善?；诜肿訕擞浀倪z傳多樣性分析可直接用于指導育種實踐，例如利用分子標記技術(shù)對作物種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性進行分析，可以幫助育種家更有目的地選擇雜組親本，提高育種效率。

2.3核心種質(zhì)構(gòu)建

對資源的廣泛征集和不斷累積交換使得種質(zhì)資源越來越多，但數(shù)量的增加并不意味著遺傳變異也得到相應增加，因為資源庫中可能含有較大比例的遺傳冗余甚至重復的材料。這就為我們種質(zhì)資源工作了提出一個新的問題，就是如何對數(shù)目龐大的種質(zhì)資源進行評價和有效利用，“核心種質(zhì)”這一概念的提出為這一問題提供了解決辦法。構(gòu)建核心種質(zhì)是提高種質(zhì)資源利用效率、提升種質(zhì)創(chuàng)新能力的基礎。另外，核心種質(zhì)本質(zhì)就是一個基因庫，在作物優(yōu)質(zhì)單元型區(qū)段(或基因)的發(fā)掘過程中也具有廣泛的應用價值。近年來，作物遺傳資源核心種質(zhì)的構(gòu)建越來越受到學者的關注。目前，我國已構(gòu)建了水稻、小麥、玉米、大豆等幾大作物的核心種質(zhì)庫。在國家973項目的資助下，我國科學家還開展了水稻、小麥和大豆核心種質(zhì)重要農(nóng)藝性狀單元型區(qū)段及互作研究，該項工作也將為以上作物的分子設計育種和遺傳轉(zhuǎn)化育種提供基因資源，為未來重要基因的合理布局提供科學依據(jù)。

3種質(zhì)資源的創(chuàng)新

種質(zhì)資源創(chuàng)新的過程，就是對現(xiàn)有種質(zhì)資源中所包含的遺傳信息采取某種手段或方法進行改變的過程，傳統(tǒng)意義上的雜交育種就是種質(zhì)創(chuàng)新的一種最基本和常用的途徑。隨著人們對生物體認識的不斷深入以及生物技術(shù)的不斷發(fā)展，種質(zhì)資源創(chuàng)新的方法也不僅僅停留和局限于通過雜交來進行，還在組織、細胞乃至分子水平上進行。創(chuàng)新途徑主要包括誘變、染色體工程技術(shù)、小孢子培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合基因工程等。近化手段、生物技術(shù)的興起也極大地提高了人們創(chuàng)造和利用變異的能力，為種質(zhì)創(chuàng)新提供了多種可利用的手段。突變體庫的建立和篩選也是基因挖掘的重要基礎。國際上已構(gòu)建了4個大規(guī)模水稻插入突變體庫。通過60Co－γ射線照射、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變等技術(shù)，各國科學家也創(chuàng)制了多個水稻、玉米、小麥、大豆等主要作物的突變體庫［4］。單倍體育種技術(shù)是近來發(fā)展成熟的、基于小孢子培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)等組織培養(yǎng)技術(shù)的育種方法，它是對植物單核晚期的花粉進行培養(yǎng)，誘導其形成胚狀體，并通過染色體人工或自然加倍產(chǎn)生純合的二倍體或多倍體植株的過程。該方法可快速獲得大量純合、穩(wěn)定的雙、單倍體再生植株，為保存和創(chuàng)造作物種質(zhì)資源提供了一條有效途徑。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展則實現(xiàn)了不同物種間基因的交流。轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標，利用現(xiàn)代生物技術(shù)從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組和遺傳轉(zhuǎn)化將其導入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達的重組單株，最終結(jié)合大田選擇和田間試驗培育新品種或新種質(zhì)的過程。該技術(shù)可以突破物種間的遺傳障礙，大跨度地超越物種間的不親和性，從而打破了遺傳物質(zhì)分類上的界限，實現(xiàn)了基因在不同物種間的轉(zhuǎn)移，大大拓寬了作物遺傳改良可供利用的基因來源［5］。目前，轉(zhuǎn)基因育種在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中都已取得成功［6］。多項研究表明，基因序列的微小變化可以對植物基因型產(chǎn)生顯著影響，從而影響植物的表型。新近發(fā)展起來的基因組編輯技術(shù)有望成為繼突變和轉(zhuǎn)基因技術(shù)之后的育種技術(shù)發(fā)展的又一個里程碑，主要包括寡核苷酸介導的定點突變、轉(zhuǎn)錄激活類似效應因子核酸酶技術(shù)、鋅指核酸酶、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列系統(tǒng)。以上技術(shù)不僅可以特異地修飾某個靶向序列，從而創(chuàng)造新的等位基因，而且與傳統(tǒng)的點突變相比，效率更高、速度更快、無多余的隨機突變。目前，基因組編輯技術(shù)在植物的抗病性、除草劑抗性以及營養(yǎng)代謝等相關領域得到成功應用［7］。我們相信在不久的將來，這些基因也將對作物育種產(chǎn)生深遠影響。

4種質(zhì)資源的利用

4.1作物種質(zhì)資源利用的傳統(tǒng)途徑

我國對種質(zhì)資源的傳統(tǒng)利用大致經(jīng)歷了直接利用、雜交育種和雜種優(yōu)勢利用3個階段。20世紀50年代初期到60年代中期，我國生產(chǎn)上以直接利用種質(zhì)資源中的優(yōu)異地方品種進行就地繁殖和推廣為主。在此基礎上，各地不但相互交換優(yōu)良品種，而且還從許多其他國家引進了多種農(nóng)作物優(yōu)良品種，并通過系統(tǒng)選擇和雜交改良等途徑，實現(xiàn)了兩次品種更新?lián)Q代，使優(yōu)良品種得到迅速普及［3］。盡管當時這些改良品種對產(chǎn)量的貢獻率比較低，但是，通過對全國種質(zhì)資源的篩選，明確了這些作物種質(zhì)資源所具有的不同特性，為后來作物新品種選育奠定了良好基礎。20世紀50年代后期，雜交育種技術(shù)初露端倪，我國就迅速推廣普及雜交育種技術(shù)，大規(guī)模獨立自主地培育主要農(nóng)作物新品種。60年代以后，我國自育優(yōu)良品種已經(jīng)覆蓋大部分生產(chǎn)面積。這期間，在第一次“綠色革命”浪潮的影響下，我國科學家利用水稻地方品種“矮子占”和小麥創(chuàng)新種質(zhì)“矮孟?！币约皬膰庖M的矮稈種質(zhì)資源育成了大量的水稻和小麥矮稈新品種，進一步提高了水稻和小麥的產(chǎn)量水平。雜種優(yōu)勢是在雜交育種過程中，后代所表現(xiàn)出的超親現(xiàn)象。早在20世紀60年代以前，一些國家就開始在玉米和高粱育種中利用雜種優(yōu)勢，并使得產(chǎn)量大幅提高。我國的雜種優(yōu)勢利用工作起步相對較晚，前期工作主要是從國外引進了玉米自交系和高粱雄性不育系，并加以利用，該項工作為我國兩系雜交技術(shù)的迅速發(fā)展奠定了基礎。20世紀70年代以來，我國“雜交水稻之父”袁隆平院士利用“野敗”不育株，實現(xiàn)了水稻的“三系”配套，成功育成了雜交稻，水稻產(chǎn)量得到大幅提高，并使得我國迅速擺脫了糧食緊缺的困擾，有效提高了我國生產(chǎn)技術(shù)水平和糧食自給能力。此后，我國雜種優(yōu)勢利用技術(shù)得到進一步發(fā)展，目前，在水稻、玉米、高梁、谷子、小麥、蔬菜、大豆、棉花、油菜等主要農(nóng)作物新品種培育過程中都不同程度地利用了雜種優(yōu)勢，不僅使得新品種的產(chǎn)量和品質(zhì)得到大幅提高和改善，同時為提升我國糧食綜合生產(chǎn)能力和國際農(nóng)產(chǎn)品市場競爭力提供了堅實的支撐［3］。

4.2與生物技術(shù)相結(jié)合的種質(zhì)資源利用途徑

種質(zhì)資源利用的最終目的是培育出新品種。目前，世界范圍內(nèi)的育種研究已從傳統(tǒng)的常規(guī)育種進入依靠生物技術(shù)育種的時代，從單個基因的測序轉(zhuǎn)為有計劃、大規(guī)模地檢測水稻等重要生物體的基因圖譜。目前，全世界已有6000多項農(nóng)作物方面的生物技術(shù)研究成果進入田間試驗，這些也表明，生物技術(shù)在作物育種中具有巨大的應用潛力。

4.2.1優(yōu)異基因挖掘。要實現(xiàn)生物技術(shù)在作物育種中的重要作用，首要任務是確定植物群體內(nèi)基因或基因片段的表達及與表型現(xiàn)象的內(nèi)在關聯(lián)。在這一過程中，目前常用的方法就是基于雙親分離群體(F2、RIL、CSSL、NIL等)的數(shù)量性狀位點定位和基于連鎖不平衡的將標記或候選基因的等位變異與目標性狀聯(lián)系起來的關聯(lián)分析，這2者都屬于正向遺傳學的研究范疇。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基于高通量測序的QTL定位和關聯(lián)分析相關研究也取得了較大進展，并顯示了廣闊的應用前景。而在反向遺傳學中，基因所影響的表型并不清楚，但可通過基于遺傳轉(zhuǎn)化所進行的基因功能獲得或缺失技術(shù)研究基因所引起的表型變異及其功能，并對其加以利用。隨著水稻、玉米等基因組測序的完成，以及結(jié)構(gòu)和功能基因組學的飛速發(fā)展，越來越多的作物中的重要性狀相關基因被克隆，如水稻中已克隆的產(chǎn)量與品質(zhì)相關基因GS3、GS5、GW2、Ghd7，抗病相關基因xa13，抗褐飛虱基因Bph14等［8］。根據(jù)已克隆的基因信息，在種質(zhì)資源中進行目的基因的等位變異分析，找到優(yōu)異的等位基因，這樣不僅能完成對現(xiàn)有種質(zhì)資源的精確鑒定，還能對鑒定的含有優(yōu)異等位基因的材料通過分子標記輔助選擇應用到育種中，從而培育出優(yōu)良的品種。而對于大麥、小麥等基因組龐大的作物來說，也可以參考水稻等模式植物的研究結(jié)果，通過同源克隆、關聯(lián)分析等策略對一些重要性狀產(chǎn)生的分子機理進行解析，并對相關基因進行功能鑒定和利用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，作物基因發(fā)掘出現(xiàn)了一些新的發(fā)展趨勢，例如基因組測序技術(shù)的更新?lián)Q代、高通量基因型和表型分析平臺的建立，都將促進基因發(fā)掘的規(guī)模化和高效化。

4.2.2分子標記輔助選擇。20世紀80年代后期，我國開始利用分子標記輔助選擇進行新品種的培育。分子標記輔助選擇的核心是借助與目標基因緊密連鎖的分子標記，直接選擇目標基因型個體。分子標記輔助選擇不受環(huán)境影響，可在早代進行準確、穩(wěn)定的選擇，而且可以克服再度利用隱性基因時識別難的問題，并能同時聚合多個目標基因，因此，可大大提高育種效率和水平。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，各主要作物越來越多的重要性狀相關基因被定位或克隆，這將極大地促進作物分子標記輔助選擇育種技術(shù)的應用。在種質(zhì)資源的應用工作中，我們應以種質(zhì)資源的鑒定評價、種質(zhì)創(chuàng)新和優(yōu)異基因挖掘等工作為基礎，通過分子標記輔助選擇，有目的的將野生近緣種屬、地方農(nóng)家品種和國外引進優(yōu)異種質(zhì)中的有益基因?qū)朐耘喾N中，從而對栽培種進行性狀改良，創(chuàng)造出一批更適合育種需要的中間材料。

4.2.3分子設計育種。種質(zhì)創(chuàng)新和基因挖掘是對種質(zhì)資源研究工作的提升，對種質(zhì)資源進行充分利用則是作物種質(zhì)資源研究工作的最終目的?？茖W技術(shù)的不斷發(fā)展將使得作物基因發(fā)掘的速度和數(shù)量大幅提高，這也將促進后基因組時代的到來，加深我們對基因互作的了解，從而揭開作物重要性狀的基因網(wǎng)絡調(diào)控途徑。因此，在創(chuàng)制一批滿足育種需要的中間材料的同時，還應著眼于未來，結(jié)合分子標記輔助選擇，將挖掘到的優(yōu)異基因?qū)氲皆撟魑锏漠斍皯脧V泛、綜合性狀優(yōu)良的某一品種中，構(gòu)建包括高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高抗等基因的一系列的近等基因系;以上述近等基因系為材料，通過基因的定向組裝達到性狀的協(xié)調(diào)改良，突破傳統(tǒng)育種的瓶頸，實現(xiàn)作物品種的精準分子設計育種。同時，我們也應該把握機遇，充分利用植物基因組學和生物信息學等前沿學科的重大成就，及時開展分子設計育種的基礎理論研究，建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的分子設計育種技術(shù)體系和技術(shù)平臺［9］。

5展望

當代生物技術(shù)的高速發(fā)展，如高通量表型和基因型鑒定技術(shù)，使得種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用的各個環(huán)節(jié)都融入了現(xiàn)代高新科技的元素。有理由相信，這些工作的順利完成將為選育突破性農(nóng)作物新品種、發(fā)展現(xiàn)代種業(yè)、保障糧食安全提供物質(zhì)和技術(shù)支撐。

參考文獻:

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第3篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

關鍵詞秀麗隱桿線蟲 模型 藥物篩選 藥靶篩選

Applications of Caenorhabditis elegans in drug screening

ZHOU Yu-meng，CHEN Dai-jie*

（Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry of China State Institute of Pharmaceutical Industry，

State Key Lab for New Drug and Pharmaceutical Process，Shanghai，200040）

ABSTRACTCaenorhabditis elegans (C. elegans) has attracted an increasing attention of pharmaceutical scientists working on drug screening. A relatively complete technology platform for drug screening has been formed by this model. The characteristics of C. elegans as new drug screening model，disease models established by C. elegans currently and their application in discovery of new drug are described in this review.

KEY WORDSCaenorhabditis elegans; model; drug screening; target of drug screening

生物學界對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的研究始于20世紀60年代。英國科學家Brenner [1]選擇了線蟲作為確定完整神經(jīng)系統(tǒng)的較為簡單的生物模型。隨后，Sulston經(jīng)過20年的努力，到20世紀90年代中期構(gòu)建了完整的線蟲細胞譜系圖，使線蟲成為唯一一個身體中所有細胞能被逐個盤點并歸類的生物。Horvitz利用遺傳突變和基因克隆等手段，揭示了線蟲細胞程序性死亡的遺傳調(diào)控機制，并證明相應的調(diào)節(jié)基因在高等動物和人體中也存在。這三位科學家的研究對生命科學領域做出了極為重要的貢獻，于2002年分享了諾貝爾生理或醫(yī)學獎[2]，使秀麗隱桿線蟲成為當代生命科學和醫(yī)學研究中最重要的模式生物之一。

近年來，秀麗隱桿線蟲在藥物或靶蛋白篩選方面越來越受到藥物學家的青睞，已形成了較為完善的藥物篩選技術(shù)平臺。本文從藥物研發(fā)的角度討論線蟲作為模式生物的特點，以及目前利用秀麗隱桿線蟲建立的疾病模型在新藥發(fā)現(xiàn)中的應用。

1秀麗隱桿線蟲整體生物模型的特點

秀麗隱桿線蟲屬于線形動物門線蟲綱動物，結(jié)構(gòu)如圖1[3]所示。利用秀麗隱桿線蟲整體生物能夠建立和模擬與人類疾病相關的模型、篩選不同的新型活性物質(zhì)并發(fā)現(xiàn)新穎生物功能的靶點或靶標，實現(xiàn)這些目標的基礎主要在于以下兩個方面。

1.1線蟲整體生物模型的優(yōu)點[4]

1）蟲體?。ǔ上x1 mm），容易操作（線蟲可以飼養(yǎng)在含有大腸埃希菌的瓊脂平板或是液體培養(yǎng)基中）并且便于長期保藏（蟲體可以凍存在甘油中）。2）發(fā)育的各個階段蟲體呈透明狀，可以通過微分干涉對比（differential interference contrast，DIC）顯微鏡和各種熒光顯微鏡對所有細胞進行觀察。3）世代和生命周期較短。在實驗室20 ℃的環(huán)境下，從卵發(fā)育到成蟲只要4 d，平均壽命為3周。4）繁殖快并且多產(chǎn)。一只雌雄同體線蟲可以產(chǎn)下300多個后代，經(jīng)雄蟲后可以產(chǎn)下1 000多個后代。5）一個雌雄同體的成蟲完整固定不變的體細胞有959個，雄蟲有1 031個。6）發(fā)育專門的生理器官，神經(jīng)環(huán)和神經(jīng)節(jié)、腸道、肌肉、皮下組織、排泄系統(tǒng)、先天免疫系統(tǒng)、性腺和子宮。7）完整的神經(jīng)網(wǎng)絡圖，302和391個神經(jīng)元組成雌雄同體成蟲和雄蟲的神經(jīng)系統(tǒng)。8）具有復雜的行為學特征，包括機械感知和化學感知，避免有害刺激物和溫度趨向性。9）擁有完善的實驗技術(shù)，包括轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)、單細胞激光光解技術(shù)、通過化學誘變和RNA干擾進行正向和反向的遺傳基因篩選、通過個體大小和熒光采用流式細胞儀對線蟲進行數(shù)量控制、表型特征對應的單細胞多態(tài)性圖譜（SNP mapping）和小分子化合物庫的篩選。10）一個完整的基因組序列，含有約19 700編碼序列和約1 300非編碼RNAs。11）完整的基因組文庫和cDNA克隆。12）一個線蟲突變保藏中心，擁有大量突變體線蟲。13）豐富的免費網(wǎng)絡資源（如WormBook）和數(shù)據(jù)庫（如WormBase）。

1.2線蟲與人類基因之間的保守性

以秀麗隱桿線蟲為模型來模擬人類疾病是最簡單直接的，但是兩者之間的藥物靶點要具有保守性。慶幸的是，這種保守性的確存在。依靠生物信息學方法，發(fā)現(xiàn)已知的秀麗隱桿線蟲藥靶基因與人類基因的同源性達到60%～80%[5]。在許多重要的信號傳導途徑中，線蟲都存在高度保守性，如與細胞增殖分化相關的途徑包括RAS信號途徑、Notch信號途徑和Wnt信號途徑[6～8]；與免疫相關的途徑包括TGF-β信號途徑、胰島素信號途徑、p38 MAPK信號途徑和Toll信號途徑[9～12]等。在孟德爾人類遺傳資料庫（Online Mendelian Inheritance in Man）的2 466個人類疾病基因中，有533個與秀麗隱桿線蟲同源[13]。

鑒于線蟲具有豐富的生物學、遺傳學信息的研究以及作為模式生物的優(yōu)越性，使其在人類疾病研究和新藥開發(fā)中發(fā)揮著重要的作用。

2基于秀麗隱桿線蟲的疾病模型及在新藥發(fā)現(xiàn)中的應用

目前，已建立了大量的秀麗隱桿線蟲模型和有效的研究方法來模擬人類疾病，并實施大規(guī)模高通量化合物的篩選。

2.1代謝綜合征疾病的線蟲模型

2.1.1糖尿病模型

胰島素超家族基因普遍存在于脊椎和非脊椎動物中。在秀麗隱桿線蟲中存在胰島素樣信號途徑（insulin-like signaling pathway），負責控制代謝、生長和壽命，其中daf-2基因編碼屬與哺乳動物同源的胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）受體家族[14]。秀麗隱桿線蟲daf-2基因突變株發(fā)育受限，只能停留在dauer幼蟲期，但當胰島素樣信號途徑被刺激后，可以二次生長，發(fā)育成成蟲，故能使daf-2基因突變株轉(zhuǎn)變成成蟲的化合物可能對人類胰島素信號傳遞存在調(diào)節(jié)作用。因此，DevGen公司利用daf-2基因突變株建立了抗2型糖尿病的藥物篩選模型，并于2001年申請了專利[15]。隨后，該公司又構(gòu)建了能產(chǎn)生定量熒光信號的daf-2基因工程蟲體，建立了高通量篩選方法。

2.1.2脂肪代謝模型

研究人員利用線蟲尋找影響脂肪代謝的相關基因，為治療肥胖和相關疾病提供研究靶點。Lemieux等[16]對3 200個化合物進行篩選，用尼羅紅（Nile Red）染色來監(jiān)測處理2 d后的線蟲脂肪水平，發(fā)現(xiàn)有2種化合物可以誘導脂肪增加、8種化合物可以降低脂肪含量。實驗人員針對F17化合物進行研究，發(fā)現(xiàn)該化合物是AMP-活化蛋白激酶（AMP-activated kinase，AMPK）拮抗劑，能有效降低線蟲脂肪儲存（見圖2[17]）。

用野生型線蟲對3 200個化合物進行篩選，2 d后尼羅紅染色并檢測脂肪水平。大部分化合物是無效的，線蟲脂肪水平與對照相似（中間的線蟲）。2個化合物可以增加線蟲脂肪含量（頂部的線蟲），8個化合物可以降低脂肪含量（底部的線蟲）。其中一個化合物F17影響脂肪含量降低是依賴于AMPK（aa-1）和轉(zhuǎn)錄因子K08F8.2。

Chronogen公司采用另外一種線蟲脂肪代謝模型[18]，利用clk-1缺陷型線蟲排便循環(huán)的長短直接受膽固醇量調(diào)節(jié)的特點，篩選了20 000個小分子化合物，得到190個陽性化合物（hits），再用人肝癌細胞HepG2驗證，其中15個化合物能減少細胞ApoB100的分泌，而化合物CHGN005效果最好。在隨后的小鼠活體高血脂模型中，CHGN005可以明顯降低膽固醇和甘油三酯的含量，進一步驗證了此化合物的活性。

2.1.3衰老模型

利用秀麗隱桿線蟲研究衰老現(xiàn)象和老化相關的疾病已經(jīng)有近30年的歷史。秀麗隱桿線蟲生命周期較短，使其成為衰老研究和抗衰老藥物篩選的理想模型。目前，主要采用野生型N2和突變體線蟲（如daf-16、daf-9等）作為實驗動物。

Evason 等[19]以具有不同結(jié)構(gòu)、不同藥效的19個經(jīng)FDA 批準的藥物組成小樣本庫篩選發(fā)現(xiàn)，抗癲癇藥物乙琥胺（ethosuximide）能使秀麗隱桿線蟲的壽命延長17%，并存在明顯的量效關系。構(gòu)效關系研究表明，與乙琥胺結(jié)構(gòu)類似并具有抗癲癇作用的化合物三甲雙酮（trimethadione）和3，3-二乙基-2-吡咯烷酮（3，3-diethyl-2-pyrrolidinone）也能明顯延長秀麗隱桿線蟲的壽命，而與乙琥胺結(jié)構(gòu)類似、但無抗癲癇作用的化合物丁二酰亞胺（succinimide）卻沒有延長秀麗隱桿線蟲壽命的作用。作者推測，可能是上述化合物的抗癲癇機制與延長秀麗隱桿線蟲壽命的機制相同、通過影響線蟲的神經(jīng)活動而導致生命延長。

Petrascheck 等[20]用秀麗隱桿線蟲篩選抗衰老藥物，篩選了 8.8 萬個化合物，發(fā)現(xiàn) 115 個化合物能延長秀麗隱桿線蟲的壽命，有4個化合物是5-羥色胺受體抑制劑，它們能使秀麗隱桿線蟲的壽命延長22%～30%，其中包括抗抑郁藥米安色林（mianserin），但米安色林不能延長對5- 羥色胺的合成、攝取發(fā)生變異的線蟲壽命。研究人員認為，米安色林能阻斷線蟲與覓食有關的神經(jīng)遞質(zhì)的信號傳遞，產(chǎn)生饑餓感，導致線蟲壽命延長。

Gerisch等[21]發(fā)現(xiàn)一種膽酸化合物dafachronic acid與秀麗隱桿線蟲的衰老調(diào)控有關。白藜蘆醇（resveratrol）能延長酵母、果蠅、小鼠的壽命，也能延長秀麗隱桿線蟲的壽命[22]。具有抗氧自由基損傷的化合物如維生素E、輔酶Q等以及藍莓、銀杏葉提取物也能延長秀麗隱桿線蟲的壽命[23]。

延長人類壽命一直廣受關注，但是有關人類生命周期的探索才剛剛起步，基因調(diào)控、系統(tǒng)調(diào)控、環(huán)境和精神因素等都在不同水平上影響人類壽命。能延長線蟲壽命的化合物（見圖3）在結(jié)構(gòu)上差異較大，說明小分子對衰老的干預具有多靶點、多機制的特征。值得注意的是，干預神經(jīng)活動的小分子能延長秀麗隱桿線蟲壽命，說明神經(jīng)活動可能與衰老現(xiàn)象有關，但是這些分子能否成為抗衰老藥物還需要一個漫長的評價過程。而白藜蘆醇是通過Sir2蛋白進行調(diào)控，與神經(jīng)干預機制無關，這種分子似乎更具有抗衰老研究的價值。

2.2神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病的線蟲模型

2.2.1阿爾茨海默病模型

研究者在線蟲中發(fā)現(xiàn)早老素（presenilin）sel-12基因，其編碼的蛋白具有多跨膜結(jié)構(gòu)域，并且與阿爾茨海默?。ˋD）相關蛋白S812相似。目前已構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因線蟲模型，將人源β-淀粉樣蛋白在線蟲中異源表達，誘導淀粉樣蛋白沉淀物形成，引起線蟲麻痹，從而導致線蟲“排卵”困難[24]。Pharmacia & Upjohn公司開發(fā)了一個“幾丁質(zhì)酶檢測”方法，可以間接地監(jiān)測排卵數(shù)量，其原理是：秀麗隱桿線蟲的胚胎會分泌幾丁質(zhì)酶，以便從卵中孵化出來。幾丁質(zhì)酶濃度越高，線蟲排卵數(shù)量越多。輝瑞公司正利用轉(zhuǎn)基因線蟲AD模型和幾丁質(zhì)酶檢測技術(shù)對10 000多個化合物進行高通量篩選，期望獲得有效的抑制劑[25]。

2.2.2帕金森病模型

利用線蟲建立帕金森病模型主要有兩種：轉(zhuǎn)基因線蟲模型和藥物誘導模型。轉(zhuǎn)基因模型是通過過量表達人源α-突觸白、導致線蟲的神經(jīng)元和樹突損傷模擬帕金森病的[26]，而藥物誘導模型是利用神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基吡啶 （1-methyl-4-phenylpyridine，MPP）選擇性誘導多巴胺神經(jīng)元凋亡，使線蟲運動能力下降、死亡數(shù)增加。Braungar等[27] 對一些帕金森病治療藥物進行評估，其中多巴胺受體拮抗劑麥角乙脲（lisuride）和阿樸嗎啡（apomorphine）以及蛋白激酶C抑制劑卡馬拉素在低劑量和高劑量時都對線蟲有治療效果。

2.2.3亨廷頓病模型

已知亨廷頓病的病因是由于亨廷頓（Huntingtin）蛋白末端的多聚谷氨酰胺（polyQ）延伸造成的。線蟲模型就是采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將人源亨廷頓蛋白的N末端基因序列注射到線蟲體內(nèi)，轉(zhuǎn)基因動物神經(jīng)細胞凋亡，出現(xiàn)神經(jīng)細胞蛋白沉積并隨年齡逐步增加的癥狀[28]。利用此模型，Voisine等[29]評估了9個可能有治療效果的藥物，其中4個能緩解polyQ的毒性，以FDA批準的亨廷頓病治療藥物光輝霉素（mithramycin）和氯化鋰表現(xiàn)尤為突出。

2.3抑郁的線蟲模型

抑郁線蟲模型研究就是利用化學遺傳學方法將抗抑郁藥物氟西汀作用于線蟲，觀察藥物對線蟲表型的影響。氟西汀會阻斷5-羥色胺再攝取轉(zhuǎn)運載體（serotonin reuptake transporter，SERT）MOD-5，增加突觸間5-羥色胺的濃度。由于5-羥色胺信號增強，從而刺激控制線蟲排卵的肌肉神經(jīng)，增加線蟲排卵量[30]。在哺乳動物中，SERT是MOD-5的同系物，也是氟西汀作用的主要靶標，說明利用線蟲模型可以發(fā)現(xiàn)治療抑郁的有效藥物。

2.4肌肉萎縮癥模型

模擬人類遺傳疾病的線蟲模型包括多囊性腎病、肌肉萎縮癥等。研究人員發(fā)現(xiàn)線蟲的dys-1基因與導致人肌肉萎縮癥（DMD）的肌萎縮蛋白基因同源，采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建突變體線蟲dys-1，此突變體表現(xiàn)出類似人類DMD的肌肉組織逐漸退化、運動能力喪失的病癥。當實施強的松治療后，這種癥狀可以得到緩解[31]。

2.5高通量篩選和靶點研究的方法

線蟲既提供了完整動物實驗系統(tǒng)，又避免了小鼠模型的高價費時，是最適合大規(guī)模藥物篩選的多細胞動物。目前，秀麗隱桿線蟲越來越受到生物化學家的青睞，利用線蟲高通量篩選活性化合物、研究藥物作用靶點正在成為流行趨勢[32～36]。Roy等[37]建立了一個24孔板高通量篩選系統(tǒng)，使用秀麗隱桿線蟲模型發(fā)現(xiàn)具有生物活性的小分子化合物，并用化學遺傳學方法鑒定化合物作用靶點。整套系統(tǒng)由兩個主要的設備組成：COPAS（Complex Object Parametric Analyzer and Sorter）Biosort和自動圖像獲取處理系統(tǒng)（見圖4[37]）。每周可以篩選化合物達到2 400個。通過觀察表型的變化（見圖5[37]），推測篩選化合物的生物學活性。為了進一步確證其作用靶蛋白，利用甲磺酸乙酯使線蟲突變，篩選對此化合物具有抗性的突變體線蟲（見圖6[37]），確定突變蛋白，最終確證作用靶標。對于靶點的鑒定大約需要幾個月的時間。

采用這套系統(tǒng)，Roy等研究人員對14 100個小分子化合物進行篩選，有308個化合物可誘導野生型線蟲產(chǎn)生表型異常，最終發(fā)現(xiàn)一個小分子鈣離子通道拮抗劑nemadipine-A。其與二氫吡啶類抗高血壓藥（DHPs）類似，能夠引起線蟲形態(tài)缺陷和排卵、產(chǎn)卵困難，通過遺傳學方法確定L型鈣離子通道的α1亞基是nemadipine-A的作用靶點，與已知的DHPs作用機制完全一致[38]。

線蟲是一種簡單的模式宿主，可以被多種人類病原菌感染和殺死，其中包括革蘭陽性菌糞腸球菌、金黃色葡萄球菌，革蘭陰性菌銅綠假單胞菌、沙門菌以及一些真菌白色假絲酵母等。Moy等首次利用秀麗隱桿線蟲這一特性，建立了糞腸球菌感染模型，對6 000個化合物和1 136個天然提取物進行篩選，其中16個化合物和9個天然提取物具有提高線蟲存活率的活性[39]。隨后，他們對方法進行改進，建立了384孔板自動化分析采集的高通量篩選系統(tǒng)[35]。這套系統(tǒng)采用SYTOX 黃染料將存活線蟲和死亡線蟲進行區(qū)分并用熒光檢測，通過對比熒光強弱判斷線蟲存活率，較之前的人工操作系統(tǒng)工作效率提高5倍以上。將篩選規(guī)模擴大到37 200個化合物和天然提取物，發(fā)現(xiàn)了28個未經(jīng)報道的具有提高線蟲存活率的活性化合物，其中有6個結(jié)構(gòu)新穎的化合物體外不影響病原菌生長，說明它們與臨床上所用的抗生素具有明顯不同的作用機制。目前還建立了白色假絲酵母-線蟲感染高通量篩選模型[32，34]，對3 228個化合物篩選，發(fā)現(xiàn)了19個化合物具有抗真菌感染活性，其中7個是臨床上用于抗真菌感染的藥物、12個臨床上沒有用作抗感染藥物，還有另外3個藥物是免疫抑制劑。這些事實說明線蟲感染模型不但可以發(fā)現(xiàn)抗感染化合物，還可以尋找到一些作用機制新穎、具有其它生物學活性、輔助抗感染作用的化合物。

3結(jié)語

在許多生物途徑中，秀麗隱桿線蟲與人類之間都具有保守性。因此，從某種程度上講，秀麗隱桿線蟲的研究數(shù)據(jù)可以預測藥物-靶標相互作用和確證靶點。通過對秀麗隱桿線蟲的研究可以更好地了解許多人類疾病的病理機制。盡管存在很多優(yōu)點，但是不可否認，秀麗隱桿線蟲體系在新藥發(fā)現(xiàn)中仍存在缺陷。例如，線蟲沒有心臟、獲得性免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等，一些分子途徑在線蟲體系中不存在，這些途徑就不能通過線蟲進行研究。此外，秀麗隱桿線蟲與人類種間距離太遠，不能完全模擬或無法模擬人類病理。因此，周密的實驗方案設計、模型潛在缺陷的克服、線蟲疾病模型和人類病理某一方面具有一致性的確證成為模型成功和新藥發(fā)現(xiàn)的關鍵。當這些條件具備時，秀麗隱桿線蟲在醫(yī)藥研究領域的價值就會更好地表現(xiàn)出來。秀麗隱桿線蟲模型為體外篩選和體內(nèi)篩選架起了一座橋梁，為新藥的發(fā)現(xiàn)增加了一個新途徑。

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第4篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

[關鍵詞]瘢痕疙瘩；Fas基因；多態(tài)性；遺傳易感性

[中圖分類號]R619+.9[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-03

Fas gene -670 polymorphism and susceptibility to keloid in a Chinese population

ZHUO Yang,ZENG Xing-ye, ZHOU Xue-xue,HUANG Da-dao,CAO Xiao-en,HUANG Zheng-lian

（Department of Surgery,the 118th Hospital of PLA,Wenzhou 325000,Zhejiang, China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between Fas-670 polymorphism and susceptibility to keloid in a southern Chinese population.MethodsThe Fas-670 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 75 patients with keloid and 120 unrelated healthy controls.ResultsThe frequency of the Fas-670 A allele among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4. 408,P=0.036). The A/G and G/G genotype distribution among keloid patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=1.051 and 1.134; P=0.305 and 0.287, respectively). However, the A/A genotype frequency among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.207,P=0.022). The Fas-670 A/A genotype significantly increased the risk for developing keloid,compared to the combination of A/G and G/G genotypes,with the odds ratio(OR) of 2.122, (95%CI: 1.105～4.077).ConclusionDetermination of the Fas-670 genotype may be used as a stratification marker to predicate high-risk individuals for keloid.

Key words: keloid; Fas gene; polymorphism; genetic susceptibility

近幾年的研究結(jié)果提示，瘢痕疙瘩成纖維細胞的過量增生和凋亡相對減少在瘢痕疙瘩的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1]。而Fas蛋白是細胞表面一種與凋亡相關的抗原，F(xiàn)as介導的凋亡被認為是介導死亡信號傳遞的最主要通道。為此,我們從分子遺傳學角度，探討Fas基因-670位點多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群瘢痕疙瘩發(fā)病風險的關系, 以便深入地、多層次地解析瘢痕疙瘩的分子生物學機制。

1對象和方法

1.1 研究對象：瘢痕疙瘩患者和正常對照人群均為浙江地區(qū)漢族居民。瘢痕疙瘩患者均經(jīng)本院臨床及病理診斷證實，共75例，其中男41例、女34例,年齡9～53歲，病變位于前胸、三角肌區(qū)及耳垂，病史6個月～15年。正常對照為有外傷史而無瘢痕疙瘩產(chǎn)生，且無瘢痕疙瘩家族史的健康居民，共120例，其中男69例、女51例,年齡13～60歲,平均年齡29.6歲。用于基因分析的DNA全部來源于研究對象的外周靜脈血，血樣本用枸櫞酸鈉抗凝，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2聚合酶鏈反應-反向點雜交（PCR-RDB）

1.2.1基因組DNA提?。翰捎帽本┵惏賱偕锛夹g(shù)有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 ASO（等位基因特異性寡核苷酸）探針設計：應用Primer Premier5.0設計探針，氨基標記，探針序列分別為：NH2-5′-CATTCCAGGAACGTCTGTGA-3′；NH2-5′- CATTCC AGA AACGTCTGT GA -3′，由上海生工生物公司合成。

1.2.3 PCR反應：用于擴增Fas基因-670位點的引物5′端標記了非同位素檢測介質(zhì)Biotin,引物序列為：Bio-5′- TGTTCACCAGAGCACGAAAG -3′；Bio-5′- GCTGGC ATCTCACTTCAGGT -3′，由上海生工生物公司合成。反應在PE-480型擴增儀(美國PE公司)上進行。在50μl反應總體積中,含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎國生物公司)。熱循環(huán)參數(shù)：95℃熱啟動2min后，95℃45sec，55℃1min，72℃/2min；共35個循環(huán) 72℃延伸 10min。取3μl擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色,紫外透射儀下觀察結(jié)果。

1.2.4 雜交：固化上寡核苷酸探針的膜條連同40μlPCR產(chǎn)物加入含5ml 2×SSC～0.1%SDS的試管中，100℃水浴變性7min，置雜交儀中42℃雜交3～6h；然后放入42℃預熱的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；將膜條轉(zhuǎn)入含2.5U辣根過氧化物酶連鏈酶抗生素蛋白的10ml 2×SSC～0.1%SDS試管中，室溫反應15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，將膜條轉(zhuǎn)入20ml顯色液[19ml 0.1mol/L檸檬酸鈉(pH5.0)中加30%過氧化氫3μl和0.1mg/ml TMB]中避光顯色5～15min,期間觀察、記錄結(jié)果。

1.3 為檢驗反向點雜交結(jié)果的正確性，隨機抽取18例PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物公司測序。

1.4 統(tǒng)計學處理：應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗分析各組等位基因和基因型頻率分布的差異，并計算表示相對風險度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidenceinterval,CI)。

2結(jié)果

根據(jù)我們設計的方案，雜交結(jié)束后膜條上格顯示藍紫色斑點為A/A基因型，中格顯示藍紫色斑點為G/G基因型，而上、中全部顯示為A/G基因型，下格為空白對照，無斑點顯示（圖1）。瘢痕疙瘩組和正常對照組Fas基因多態(tài)性比較如表1、2所示。

實驗中，在瘢痕疙瘩和正常對照組間的年齡構(gòu)成比例相似，對照組及瘢痕疙瘩患者組的Fas-670位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡的情況下，結(jié)果顯示：①瘢痕疙瘩組的A等位基因頻率(54.7%)明顯高于正常對照組(43.8%)(χ2=4.408,P=0.036,P＜0.05)；而瘢痕疙瘩患者的A/G、 G/G基因型頻率分別為40.0%和25.3%， 與正常對照組相比差異無顯著性 (χ2值分別為1.051和1.134； P值分別為0.305和0.287)；②瘢痕疙瘩組的A/A 基因型頻率為34.7%，明顯高于正常對照組(χ2=5.207,P=0.022,P＜0.05)。與A/G、G/G基因型相比，A/A 基因型者患瘢痕疙瘩的相對風險性(OR)明顯增高(OR=2.122,95%CI: 1.105～4.077)。我們隨機抽取的18例PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與反向點雜交結(jié)果完全吻合（圖2），證明了聚合酶鏈反應-反向點雜交結(jié)果的正確性。

3討論

近年來，遺傳因素在許多疾病的發(fā)生中所起的重要作用備受重視，且已發(fā)現(xiàn)了多種易感基因的存在。Fas基因即是目前較為關注的與瘢痕疙瘩疾病相關的基因之一。人Fas基因組DNA位于染色體10q24上，是全長36Kb的單拷貝基因，由8個內(nèi)含子及9個外顯子組成，編碼335個氨基酸，其全稱是factor associated suicide，又稱CD95/APO-1，屬于NGF/TNF受體家族，其相應的配體及單克隆抗體與之結(jié)合后可誘導細胞凋亡。Fas蛋白包括膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)，F(xiàn)as蛋白的重要功能結(jié)構(gòu)“死亡域”編碼區(qū)位于膜內(nèi)區(qū)[2]。已證實FasR-FasL系統(tǒng)在調(diào)控細胞增殖和凋亡中起著重要的作用[3-4],Fas介導的凋亡被認為是介導死亡信號傳遞的最主要通道。

Fas 基因啟動子區(qū)域存在兩個多態(tài)性位點[5],其啟動子-670 核苷酸APG多態(tài)性位點位于核轉(zhuǎn)錄元件GAS 中,能影響干擾素的信號傳導。干擾素與其受體結(jié)合后,激發(fā)了酪氨酸激酶Jak(janus kinases),使轉(zhuǎn)錄信號傳導和激活因子-1(signal transducers and activitors of transcription1,STAT1) 酪氨酸磷酸化,磷酸化的STAT1 形成同源二聚體與GAS元件結(jié)合,誘導含有GAS元件的基因轉(zhuǎn)錄[6]。當然其他細胞因子與其受體結(jié)合后,也可通過STAT家族成員誘導含有GAS元件的基因轉(zhuǎn)錄[7]。若Fas-670 位點堿基為G,則含有GAS元件的一致序列TTCNNNGAA(N3 位點) ,該序列能被STAT家族的多數(shù)成員識別[8],細胞因子-受體作用激活STATs,從而誘導Fas基因轉(zhuǎn)錄。而堿基A代替G后,則DNA序列變?yōu)門TCNNNAAA,可能影響Fas轉(zhuǎn)錄，影響Fas蛋白表達。已有報道其他基因GAS元件能夠影響轉(zhuǎn)錄水平[9]。

國外對Fas-670位點多態(tài)性與自身免疫性疾病相關性研究,提示AA 基因型與白種人類風濕性關節(jié)炎的臨床亞型相關[10]，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化患者A等位基因頻率顯著增高[9-10]。然而,國內(nèi)外尚未見Fas 基因多態(tài)性與瘢痕疙瘩的相關性研究。本研究初步結(jié)果提示，F(xiàn)as基因-670位點A等位基因及AA基因型是中國浙江地區(qū)人群對瘢痕疙瘩的易感因素。我們的初步研究結(jié)果對瘢痕疙瘩的預測診斷及篩選具有較大潛在的臨床意義，然而更大樣本、更多地域、多民族的印證研究尚有待完善。

本實驗采用的聚合酶鏈反應-反向點雜交方法是由Saiki RK[11]于1989年首次提出，雖然在原理上與正向斑點雜交相似，但卻巧妙地反其道而用之,即反方向的將各種探針固定在基質(zhì)上,用以檢測受檢的各種標記樣品中與探針互補的核酸物質(zhì)的變化。近年來應用此法進行β-地中海貧血、囊腫性纖維化等疾病的基因診斷，取得較好效果。該方法分辨率高，技術(shù)簡便、快速、可靠，其檢測結(jié)果與DNA測序符合率高，值得推廣應用。

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第5篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

[關鍵詞]生命倫理學；中國難題；現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)

[中圖分類號]B82～05[文獻標識碼]A[文章編號]1671-511X（2012）02-0005-06

一、問題的提出

生命倫理學的誕生和發(fā)展，與現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的高速發(fā)展及其不斷展現(xiàn)的復雜而多變的“醫(yī)療實踐”領域及其急速變革有關。進入20世紀以來，現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)以前所未有的方式凸現(xiàn)出日益尖銳的生命倫理難題，它們在不斷地“書寫”人類依靠技術(shù)治療疾病、增進健康、強化生命的各種“傳奇”的同時，也對人類的倫理規(guī)范和法律制度帶來了前所未有的挑戰(zhàn)。一種我們可以稱之為“醫(yī)療-技術(shù)”現(xiàn)象（或者“技術(shù)-醫(yī)療”現(xiàn)象）的醫(yī)學進步和生命倫理實踐，正在不斷地將遺傳學、神經(jīng)科學（腦科學）、干細胞技術(shù)、基因技術(shù)和計算機輔助技術(shù)（例如影像技術(shù)）等現(xiàn)代科學技術(shù)，帶人醫(yī)療實踐；而與此同時，幾乎每一項由現(xiàn)代科技進步帶來的醫(yī)學進步，都對舊有的生命倫理學理論與實踐以及與之相關的醫(yī)事法學帶來咄咄逼人的挑戰(zhàn)。生命倫理學面臨如許眾多的質(zhì)詢，例如：如果我們相信技術(shù)進步能夠帶來醫(yī)學進步（這一點我們堅持一種樸素的信念），那么它如何才是一種道德的進步以及法律的進步？該問題使得現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)所開啟的醫(yī)療技術(shù)行為，儼然成了從生命倫理學視野上影響現(xiàn)代技術(shù)挑戰(zhàn)倫理及法律問題的“爆發(fā)地”！而每一次技術(shù)對倫理或法律的挑戰(zhàn)（如器官移植技術(shù)、克隆技術(shù)、基因診斷技術(shù)、以神經(jīng)科學為基礎的腦服務技術(shù)等），都迫使科學家、醫(yī)生、法學家、社會學者、政府、媒體和公眾必須動員起來尋找應對的良方。各種各樣的倫理難題、法律難題和倫理一法律難題仍然如揮之不去的魅影，與現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)及其醫(yī)療實踐如影隨形。

于總體上看，生命倫理學的中國難題，以現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)為例，主要集結(jié)于現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中的倫理難題以及法律難題。從邏輯上看，它大致包括倫理難題、法律難題以及倫理一法律難題三個方面。

其一，倫理難題。即使法律支持該技術(shù)，我們在倫理上仍然面臨無法解決的難題，存在著諸“理”之沖突而每一種“理”都有理的情況。倫理難題的典型形式有三種：（1）倫理與倫理之間的沖突。即有兩種倫理，一種是從個體自由出發(fā)的倫理（它主要關涉權(quán)利問題），一種是從總體責任出發(fā)的倫理（它以義務為首要原則），這兩種倫理在特定的醫(yī)療技術(shù)境遇中，存在相互沖突的情況。（2）一種倫理體系的內(nèi)部存在著的道德與道德之間的沖突。即醫(yī)療行為主體之間（醫(yī)生與病人）可能存在道德理由或道德主張上的分殊和相互沖突的情況，從而在醫(yī)生的權(quán)利與病人的權(quán)利之間產(chǎn)生尖銳的道德沖突。（3）在一種集團倫理或組織倫理的特定境遇中存在著倫理與道德之間的沖突。比如醫(yī)院組織對個體有普遍性的倫理約束，而個體的道德原則又可能存在著與組織的倫理規(guī)約相沖突的情況，于是在特定的醫(yī)療技術(shù)行為中，出現(xiàn)了“道德的個人和不道德的組織”這樣的倫理一道德悖論。

其二，法律難題。廣義的法律難題必定是從倫理難題而來，然而在生命倫理學中存在著一類相對狹義的法律難題，它將倫理的討論存而不論，在尋求一種“倫理中立”的法律解釋和立法實踐的過程中遇到了支持與反對都有法律依據(jù)的情況，包括兩個方面：一是法律解釋的難題，如兩種解釋都可能是正確的，但它們彼此相互沖突；一是立法依據(jù)的難題，在是否立法（比如針對安樂死或醫(yī)自殺的藥物和技術(shù)的應用問題）以及如何立法等問題上皆存在著相互抵牾的主張，且似乎各自都能自圓其說。

其三，倫理一法律難題。倫理一法律難題或者主要地由倫理難題而來，或者主要地由法律難題而來，它是內(nèi)含著倫理和法律因素且在二者之相互關聯(lián)問題上呈現(xiàn)的難題。代表性的倫理一法律難題有兩大類：（1）現(xiàn)有倫理上的析理無法為法律上的適用提供依據(jù)，而現(xiàn)有法律規(guī)范或解釋又無法體現(xiàn)倫理的價值、原則和道德理由，于是出現(xiàn)了倫理失靈和法律失靈的情況；（2）又或者，倫理上的支持和反對都符合法律解釋原則，而法律上的支持和反對都有強有力的倫理上的支持。倫理分析、道德論爭和推理是法律問題之求解的基礎，許多法律難題的產(chǎn)生乃由于倫理難題尚得不到治理或澄清；同樣，法律的解決方案往往又作為權(quán)宜之計不能真正地為倫理難題找到出路。

二、生命倫理學的中國語境與問題癥候

近十年來，伴隨著克隆的多利羊（1997年）的誕生以及人類胚胎干細胞被成功地分離（1998年），以及人類基因組圖譜的繪制成功等一個又一個的技術(shù)進步及其在醫(yī)療實踐中的運用，生命倫理學愈來愈聚焦于現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)及其醫(yī)療技術(shù)實踐所展現(xiàn)的倫理難題、法律難題以及倫理一法律難題。生命倫理學的中國語境亦受到醫(yī)療技術(shù)最新進展的影響：（1）在漢語語境下，現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)對倫理與法律的挑戰(zhàn)，成為亟需從文化、社會、宗教、倫理、法律等人文價值世界領域進行治理的難題；（2）而一些似乎已經(jīng)被解決的問題（如腦生或腦死的問題）又重新成為新的倫理一法律難題；（3）由于現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)及其臨床研究和應用，前所未有地關涉到相關主體的權(quán)利、責任、義務和相關制度的公正問題，以及前所未有地標示出技術(shù)本身存在的大量風險和不確定性，因此它必須獲得倫理與法律的支持，且極大地依賴于倫理難題或法律問題的治理或解決。在復雜的國際背景下，各國政府被迫對現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的倫理與法律挑戰(zhàn)作出回應，即從倫理治理與法律對策兩個方面籌劃或者設計一種有利環(huán)境，既促進現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)（尤其是高新生物醫(yī)學技術(shù)）的發(fā)展，又盡量避免社會被高新技術(shù)所侵害。這使得生命倫理學的研究于總體上愈來愈面向“應用”，且愈來愈介入具體的社會決策或社會行動。例如：針對干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學等高新生命技術(shù)的醫(yī)療實踐及其產(chǎn)生的生命倫理難題，英國于2005年通過英國經(jīng)濟和社會研究理事會啟動了“社會科學干細胞行動”，鼓勵人文學者、倫理學家、法學家等介入這一領域；歐盟的BIO-NET項目，旨在希望中歐合作研究生物醫(yī)學技術(shù)中的倫理治理問題。

中國衛(wèi)生部于2009年3月2日出臺了《醫(yī)療技術(shù)臨床應用管理辦法》。這個文件可以視做我國從政策層面應對現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)帶來的各種問題（尤其是倫理問題與法律問題）的官方文件，是一個里程碑式的文件。它對我國醫(yī)療領域的技術(shù)創(chuàng)新和醫(yī)療抉擇有指導性的作用。然而，這個“管理辦法”并不是我們解決現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的倫理與法律問題的“靈丹妙藥”，由于遇到的問題有些是非常棘手的倫理難題或法律難題，它甚至無法給出具體的實施細則。因此，中國生命倫理學亟需完成一種“語境梳理”，即從理論與實踐兩個方面，從更廣泛深入的實踐探索中，以及更多維交叉的跨學科視野的關注或研究中，尤其重要的是在與科學家或醫(yī)療領域研究者和實踐者的對話研究中，進一步探討我國現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中的倫理治理和法律對策。

另一方面，我們應該看到，現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)在中國醫(yī)療實踐領域的研發(fā)、傳播和使用，除了造成普遍的倫理與法律問題之外，也正在形成“醫(yī)療技術(shù)的中國問題”。這些問題主要表現(xiàn)在：第一，現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)明、應用及其對社會整體的影響，對中國人的傳統(tǒng)哲學觀、價值觀、生存方式和生活方式的沖擊，讓中國人產(chǎn)生越來越大的“隔離”感；第二，各種高新生命技術(shù)的研發(fā)和使用，也正在影響著人們的具體生活，比如，醫(yī)療上的器官移植技術(shù)、基因診斷技術(shù)、試管嬰兒技術(shù)，等等，這些技術(shù)的使用也正在考驗中國人的倫理意愿，改變中國人的道德生活方式，同時也對現(xiàn)有的法律解釋提出了挑戰(zhàn)；第三，由于中國傳統(tǒng)倫理道德、社會文化形態(tài)和生活思維方式，與主要是在西方文化傳統(tǒng)上建構(gòu)起來的現(xiàn)代性醫(yī)療技術(shù)體系存在一定的差異，一些在西方語境中可以發(fā)揮作用的倫理或法律規(guī)范有可能在中國社會失效，從而形成了具有中國特色的“中國生命倫理學難題”。

生命倫理學的中國語境，一般而言，源于現(xiàn)代社會對現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中產(chǎn)生的與權(quán)利、義務、責任和公正有關的倫理及法律問題的廣泛而深刻的關注與激烈的論辯；特別地說，源自醫(yī)療技術(shù)在挑戰(zhàn)倫理及法律的過程中，對中國醫(yī)療民生和中國醫(yī)療技術(shù)進步帶來的重大影響。

從學說史的角度或者學術(shù)語境看，中國大陸學者對生命倫理的中國難題的研究和關注，是與生命倫理學這門新興交叉學科在中國大陸的產(chǎn)生、發(fā)展和不斷成長的歷程密不可分的。一般認為，大陸生命倫理學開始于1979年，以美國肯尼迪研究所的學者訪問中國社會科學院哲學所為事件的標記。同年12月全國醫(yī)學哲學的會議在廣州召開，會上著名的生命倫理學家、中國社會科學院哲學所邱仁宗研究員介紹了英語國家有關輔助生殖技術(shù)，腦死亡和安樂死及其他生命倫理學問題的爭議。1980年，《醫(yī)學與哲學》雜志創(chuàng)刊，邱仁宗研究員的開篇論文為“死亡和安樂死”。1987年，邱仁宗教授出版了《生命倫理學》一書，成為將美國和西方生命倫理學介紹到中國的開篇著作。1988年10月《中國醫(yī)學倫理學》創(chuàng)刊。1988年7月全國“安樂死倫理、法律、社會問題”研討會召開，1988年11月“人工授精的倫理，法律，社會問題全國會議”召開。上述兩本雜志的出版，兩個會議的討論，標志著大陸生命倫理學的正式開始。從1997年至今，大陸生命倫理學進入了“體制化”和“法規(guī)化”的新階段。更多的機構(gòu)審查委員會（IRB）或醫(yī)學倫理委員會建立了起來，生命倫理學的研究更多集中在制訂符合生命倫理的政策和法規(guī)上。同時，也有許多學者試圖從中西方文化的傳統(tǒng)資源中尋找生命倫理學中國化的啟示，有所謂“儒家生命倫理學”、“道家生命倫理學”、“基督教生命倫理學”等學術(shù)探索和有益嘗試。

然而，客觀地分析生命倫理學的中國語境，有兩大問題癥候不可不察：一是缺少“對話”；二是不夠“關心”。前者突出地表現(xiàn)為，倫理學家、法學家和科學家往往各自以一種自說白話的“自信”來應對或解決難題，但并未真實地面對問題；后者突出地表現(xiàn)為，中國生命倫理學熱心于追蹤生命倫理前沿問題，對中國生命倫理的問題現(xiàn)狀缺乏調(diào)查研究的熱忱或者不夠“關心”，對中國醫(yī)療民生難題缺少足夠的關心，因而不能真正地立足于中國本土并面向中國問題。因此，在現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)對生命倫理及法律帶來的嚴峻挑戰(zhàn)中，中國生命倫理學面臨的更為緊迫而重大的難題是：如何在強調(diào)“對話實踐”和關注“中國問題”的基礎上，面對現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中的倫理及法律難題，分析我們進行醫(yī)療抉擇的理由和治理方案，探索中國生命倫理面臨的困境和體系構(gòu)建的路徑，并給出相關問題的國情調(diào)研或國情對策。這意味著，生命倫理學的中國難題亟需完成兩大語境的梳理：

其一是生命倫理學作為“對話的倫理學”的理念的確立?！皩υ挕崩砟畹暮诵?，是生命倫理學在跨學科的條件下，真實地面對現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中的倫理及法律問題，推進倫理學家、法學家、科學家、醫(yī)生、政府主管部門以及公眾進入深層次對話與商談的學術(shù)旨趣或良知抉擇。因為，無法對話的、或者只是尋求獨自的生命倫理學，習慣了將現(xiàn)有的道德理論或權(quán)利理論（如道義論、后果論和四項原則或者附加原則）應用到現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的倫理及法律問題的分析或解決上，往往使得倫理學家和法學家無法真正地溝通或理解，他們與科學家或醫(yī)療（衛(wèi)生）政策的制訂者，亦存在著不利于對話或商談的知識“偏好”或?qū)W科“阻隔”，這不利于相關難題的梳理與解決。生命倫理學中國難題要完成語境梳理，首先必須作為融合或打通“人文價值世界”和“醫(yī)療技術(shù)世界”的對話實踐才是可行的；其“生命力”并不主要地在于探討某些備選原則的應用問題，（當然這些原則的討論同樣也是非常重要的）而是力圖在推進對話或商談實踐上有所作為，并在肅清問題或治理難題的基礎上探討我們?nèi)绾螒獙ΜF(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中的倫理、法律難題。

其二是生命倫理學的中國理念的確立和中國問題的應對。生命倫理學是在以問題或難題為取向的研究中產(chǎn)生和發(fā)展起來的，它在兩個視野上展開相關難題的分析與治理：一是與醫(yī)療民生相關；一是與醫(yī)療技術(shù)的最新進步相關。中國理念和中國問題，無疑是我國生命倫理學應對現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中的倫理與法律難題的基本立足點。它在現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)之總體進展中，確定了面向中國醫(yī)療民生難題和中國技術(shù)進步難題的價值旨歸。因此，盡可能多地關注中國的醫(yī)療民生，以及盡可能多地針對中國問題的現(xiàn)狀進行調(diào)查研究，是中國生命倫理學的立身之本。

三、生命倫理學的中國形態(tài)及構(gòu)建方向

一般意義上的生命倫理學是與生命科學和醫(yī)療技術(shù)相關聯(lián)的應用倫理學。然而，在當代漢語語境或者在生命倫理學面臨的中國難題的意義上，我們可以思考生命倫理學作為一種新型倫理形態(tài)（Ethictopology）的意義。一方面，中國語境將從一種倫理觀的意義上揭示生命倫理學的中國形態(tài)作為涵蓋生命科學、醫(yī)學、倫理學、法學、社會學等諸多學科的生態(tài)文化系統(tǒng)的本質(zhì)，及其對重整人類性或民族性的倫理生活形態(tài)的醫(yī)療實踐運動的重要價值；另一方面，中國生命倫理的“形態(tài)”理念，將從總體上回應現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)在醫(yī)療實踐中帶來的世界性的倫理、法律和社會問題，實現(xiàn)一種立足于中國倫理現(xiàn)實和法律實踐對現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)進入倫理和法律的路徑辨識或探索，建構(gòu)中國醫(yī)療技術(shù)的生命倫理體系，從原則和理論、問題和難題、政策和實踐三大向度建構(gòu)倫理體系和法律解釋框架。從這一意義上看，中國生命倫理學的研究路徑，首先依賴于我們?nèi)绾位氐街袊鼈惱淼摹暗赖锣l(xiāng)土”，以一種科學的調(diào)查研究的審慎性、精確性和實證性，捕捉中國生命倫理的問題境域及其客觀現(xiàn)實。我們過去關于醫(yī)療技術(shù)的生命倫理和法律研究，或者主要地關注抽象的理論思辨而缺乏現(xiàn)實關懷，或者著眼于具體境遇中的具體因素而缺乏整體架構(gòu)，缺乏對相關主體或利害相關人的主觀倫理意愿的調(diào)查研究；而實際上，回歸中國語境的最初步伐，必然是以當代中國人對醫(yī)療技術(shù)問題的倫理意愿為核心進行的實證調(diào)查，這是一項為生命倫理的中國形態(tài)奠基的工作。在此基礎上，突破過去按照技術(shù)分類體系展開、以具體問題為直接對象、即時性的和碎片化的研究范式，建構(gòu)一個將具體技術(shù)活動形態(tài)和歷史背景、價值觀念、道德意見、生活境遇、實踐者意愿、社會責任、法律規(guī)范以及未來發(fā)展訴求整合在一起的分析模式。進而，通過理論和實踐研究，在綜合醫(yī)療科技行為帶來的醫(yī)療倫理、法律和社會問題的基礎上，為中國未來醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)和醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，有針對性地在調(diào)查研究的基礎上，在重大倫理難題和法律難題的治理和應對，以及道德文化建設、社會制度建設、立法與法治化建設，和未來發(fā)展總體戰(zhàn)略等方面，提供一系列的對策建議、理論論證和國情分析。

基于對生命倫理學的中國形態(tài)的一種理論預設和學術(shù)期待，我們多少能夠展望一下中國語境下的生命倫理學在其形態(tài)構(gòu)建上亟待完善并著力建構(gòu)的三大方向：

第一，宏觀視野上的突破。生命倫理學是一個包含了生物學、醫(yī)學、社會學、法學和倫理學等諸多學科，高度交叉與綜合的創(chuàng)新性研究系統(tǒng)，是以倫理學為主軸貫通自然科學、社會科學與人文學科三大領域，圍繞“現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)”、“生命的診治或加強”、“社會、法律、文化”三大關鍵論題展開的理論與實踐緊密結(jié)合的綜合型論題。生命倫理學的中國形態(tài)必須厘清這三大概念的區(qū)別、聯(lián)系及其各自的問題范圍。因此，宏觀視野的研究，主要是運用倫理學案例分析和道德哲學反思的方法，從多學科交叉融合的視野上基于對倫理難題與法律難題的領域界劃或治理機制的探索，分析研究現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)作為一種現(xiàn)代性的醫(yī)療一技術(shù)現(xiàn)象在醫(yī)療實踐中帶來的倫理難題和法律難題。倫理是在“道德原理”和“道德規(guī)范”的論證、辯護、反思和批判的意義上為法律的應用或立法實踐提供應然性之評判、正當性之理據(jù)和善的目標參照，它在“活的好”與“做的好”兩個方面關涉權(quán)利、義務和責任問題，并將之融合到道德論辯和法理依據(jù)的分析之中，為法律問題的解決，特別是立法實踐提供原理支持、原則辯護和價值引導；法律則是通過強制性的規(guī)范體系包括立法、判例和針對具體問題的司法解釋，體現(xiàn)倫理的價值、原理、原則和規(guī)范，它在強制性規(guī)范或判例的“適用”層面，以不容爭辯的形式關涉權(quán)利、義務和責任，面向行為或應用層面解決有關難題。而“現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)”作為人的“醫(yī)療技術(shù)行為”，將醫(yī)療技術(shù)變革與生命倫理突破以一種亙古未見的方式相互緊密關聯(lián)起來了，它凸顯了技術(shù)干預所進入的“從生到死”的生命之過程，以及“從身體到心靈”的生命之體系，從而在實踐上給醫(yī)療抉擇帶來了各種各樣棘手的倫理難題和法律難題。這一研究進路，并不僅僅是為了描述或者討論在技術(shù)發(fā)展、運用的具體過程中產(chǎn)生的具體的倫理和法律難題，而是將“現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)”視為一個動態(tài)演進的現(xiàn)代技術(shù)變革與人類醫(yī)療實踐相互融合的過程的基礎上，揭示技術(shù)活動與人類倫理生活和法律秩序之間的本質(zhì)關聯(lián)，并在此基礎上去審視由于現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)所引發(fā)的一般社會問題、生命倫理難題和法律難題的產(chǎn)生根源、呈現(xiàn)形式和治理機制，為從理論上解決這些問題奠定邏輯和概念基礎。

第二，中國生命倫理狀況及法律問題的調(diào)查。生命倫理學的研究，在其本質(zhì)上是對人類生存實踐活動的直接關照，因此，通過社會學的實證研究來發(fā)現(xiàn)當代中國醫(yī)療技術(shù)實踐中存在的問題，是理論研究和對策研究的必要基礎和基本前提。生命倫理學的中國形態(tài)及其構(gòu)建路徑，其真實的開端處或起點處，乃在于我們運用社會學調(diào)查方法，比如通過文獻研究、深度訪談、問卷被試和現(xiàn)場考察等諸多路徑，獲取中國本土面臨的醫(yī)療科技的倫理及法律問題的數(shù)據(jù)庫和典型案例，以為進一步的綜合研究提供調(diào)查分析之依據(jù)。比如說，我們可以根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中人與人之間或者人與物（或者以技術(shù)為中介）之間的權(quán)利、義務、責任和公正四大主題，設定相關問卷，對其中產(chǎn)生的生命倫理及其法律問題進行社會倫理狀況的調(diào)查，獲得中國本土（通過多群體分類調(diào)查）看待現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)及其應用的主觀意愿方面的第一手數(shù)據(jù)和案例。這將使生命倫理學的中國語境變得清晰、明確、有力，從而使得生命倫理學的語境梳理真正向中國的現(xiàn)狀和國情靠攏，找出中國問題的特殊難題。以醫(yī)療技術(shù)的生命倫理和法律的中國難題為例，可能有三種具體表現(xiàn)形式：普遍性問題，普遍性問題在中國語境中的特殊表現(xiàn)，以及發(fā)源于中國現(xiàn)實的特殊問題。我們?nèi)绾螌@些問題進行區(qū)分并加以科學的描述，清理出造成這些區(qū)別的中國歷史文化和現(xiàn)代社會生活條件，準確把握當代中國人的倫理、法律和醫(yī)療生活的真實狀況，以及我們?nèi)绾握J識、理解和應對這一生存境遇及其中蘊含的生活體驗和倫理意愿，決定了我們的生命倫理學研究開啟或者梳理中國語境的基本方式及其特有的學術(shù)品質(zhì)。

第三，重大應用難題和前沿問題研究。生命倫理學的中國難題關涉諸多復雜艱巨的問題域或問題系列。在現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的范例中，核心的問題軸線是以“生命倫理”為基點或主軸，通過倫理分析和法律分析力圖辨析或澄清醫(yī)療技術(shù)行為中面臨的權(quán)利、義務、責任和公正等方面的倫理難題、法律難題和倫理一法律難題。因此，生命倫理學的中國語境，除了要在宏觀理念研究的推進策略上根據(jù)倫理難題、法律難題、倫理一法律難題的問題軸線展開，還必須面對具體的重大應用難題和前沿問題，強調(diào)從“倫理觀念變革”的意義上理解現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)以及在倫理一法律難題的具體問題境遇中展開道德辯護、倫理分析和法律分析。這表明，我們在問題域和研究對象的劃分上，要通過綜合醫(yī)療技術(shù)行為對生命過程或生命體系的干預，以及醫(yī)療技術(shù)發(fā)展演進的邏輯線索，對現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中的生命倫理的語境進行梳理。比如說，我們可以從兩大軸線上捕捉其中遭遇的重大應用難題或前沿問題：（1）在技術(shù)演進或變革的歷史軸線上，梳理出“常規(guī)治療技術(shù)”、“高新生命技術(shù)”和“涉及人類發(fā)展性需求的醫(yī)療技術(shù)”三大類；（2）在技術(shù)與人（醫(yī)療主體）相關的空間軸線上，梳理出與身體相關、與神經(jīng)或心靈相關、與遺傳和世代相關三大類。由此，形成了一個由“時空交織”的問題網(wǎng)絡，并系統(tǒng)探討其內(nèi)在倫理難題、法律難題和倫理一法律難題的立體性的應用難題和前沿問題?，F(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)對人的生與死、身與心、遺傳與世代等至為根本的生命之過程和生命之體系進行操作、干預或控制，對現(xiàn)有的（包括傳統(tǒng)的）倫理觀與法律規(guī)范體系帶來了重大挑戰(zhàn)和沖擊。

四、生命倫理的道德前景與研究路徑

當代生命倫理學是一個涵蓋了生命科學技術(shù)、倫理學、哲學、法學、社會學和社會實踐活動的生命文化運動，生命倫理學及其原則（四原則）的討論就是在這一背景下展開的。在半個多世紀的探索中，國際生命倫理學的研究不斷地在道德論辯和法律解釋兩個維度對有“喬治頓咒語”（尊重、行善、無害和公平）之稱的規(guī)范體系提出了嚴肅的批評和質(zhì)疑，生命倫理學的眾多研究成果都試圖對原則進行重新審查或補充。因此，以生命倫理為主軸，將道德理由（辯護和論辯）和法律依據(jù)的探討作為生命倫理體系的兩翼，突破現(xiàn)有的生命倫理學的進路，是生命倫理學面向中國問題或中國語境進行醫(yī)療抉擇和問題治理的必然選擇。中國生命倫理的道德前景，有賴于這種理論與實踐之良性互動的生命倫理運動之勃興，以及我國生命倫理學理論研究在進入或梳理自身語境時貫通宏觀與微觀、理論與實證、哲學論辯與難題治理等區(qū)隔或阻滯所具備的實踐智慧。

從這一意義上看，生命倫理學的中國難題，擇其要者而言，主要地是由一系列嵌入在當代中國醫(yī)療技術(shù)實踐中的倫理難題、法律難題和倫理一法律難題構(gòu)成的，它本身預設或者預期了一個與中國醫(yī)療民生和醫(yī)療技術(shù)實踐密切關聯(lián)的生命文化運動（或生命倫理運動）的可能。生命倫理學的中國難題的展開及其研究范例的形成，從一種倫理形態(tài)的意義為中國生命倫理的道德前景指引著方向。它強調(diào)以中國生命倫理的理念，回應以生命科學技術(shù)和神經(jīng)科學為主體的現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)在醫(yī)療實踐中帶來的世界性的倫理、法律和社會問題；強調(diào)在綜合醫(yī)療科技行為帶來的醫(yī)療倫理、法律和社會問題的基礎上，建構(gòu)中國醫(yī)療技術(shù)的生命倫理體系。這意味著，一種著眼于生命倫理之道德前景的生命倫理學研究，必須格外重視其對中國未來醫(yī)療（衛(wèi)生）事業(yè)發(fā)展之民生價值內(nèi)涵的關注，所以既包括對實踐問題進行理性反思的研究，也包含對具體問題進行理論分析、論證和理論指導，以及在社會政策、制度和國家法治建設方面的指導策略，和面對具體實踐問題時所應采取的倫理和法律技術(shù)策略。因此，這是一個涵蓋了基本理念、理論邏輯、政策和制度設計、法律規(guī)范體系和具體行動技術(shù)策略，并以促進和改善中國未來生命科學技術(shù)體系、醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)和社會和諧發(fā)展為最終目標的系統(tǒng)工程。

基于以上分析，我們認為，中國生命倫理學在研究路徑方面面臨三大轉(zhuǎn)型：

其一，以“對話”和“商談”的研究方法，推進生命倫理學的跨學科研究。我們在生命倫理學的中國難題的應對方略上倡導一種“對話”和“商談”的倫理學，用意乃在于：力圖使得“以問題為取向”的生命倫理學在一種跨學科對話和跨文化商談中，打破學科壁壘，打通人文價值世界和醫(yī)療技術(shù)世界的阻隔，以“對話倫理學”的交叉融合的視角，進行難題分析、現(xiàn)狀調(diào)查、問題治理，并提供指導醫(yī)療抉擇的對策建議，從而進一步推進生命倫理學的跨學科研究。我們知道，對當代生命倫理學而言，現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)所產(chǎn)生的生命倫理和法律問題，已不再是單個學科的事情，而是一個關涉多個學科的集群性問題，沒有多學科的共同介入和合作研究，人們無法真正回應這些重大的現(xiàn)實問題以及由之產(chǎn)生的諸種理論問題甚至文化問題。在強調(diào)多學科的共同合作和研究的同時，運用對話和商談的研究方法，力圖打破原有的學科界限，在眾多相關交叉研究視域中（比如醫(yī)學倫理、醫(yī)學社會學、醫(yī)事法學、倫理社會學、法倫理等）進行問題分析和理論探析，這不但能改變以前各學科各自為伍、單兵作戰(zhàn)的“獨白敘事”的狀況，促進學科交叉與融合，還能形成以問題為中心的多學科研究方法，形成一種跨學科的研究進路。

其二，以對“問題”或“難題”的充分關注，推進生命倫理學的跨文化研究。生命倫理學從其誕生之日起就被界定為：運用種種倫理學方法，在跨學科的條件下，對生命科學和醫(yī)療保健的倫理學維度，包括道德見解、決定、行動、政策，進行系統(tǒng)研究的學問。以問題為取向的研究路徑，在生命倫理學和醫(yī)事法學的研究進展中，在根本上顛覆原有的關于理論與實踐、思想與世界的關系的傳統(tǒng)認識，它使得生命倫理學總是在一種倫理突破的意義上，著意去介入、去發(fā)現(xiàn)或者重建一種生機勃勃的倫理生活及法律秩序的可能性。在這個意義上，中國醫(yī)療技術(shù)的生命倫理學和法學的應用研究，既是世界倫理學形態(tài)整體變革之大潮的一個組成部分，也是我們創(chuàng)建新的、順應世界潮流而又具有中國特色的中國倫理文化運動的一個具體實踐環(huán)節(jié)。雖然今天的生命倫理學理念主要是發(fā)端于西方文化傳統(tǒng)之中，但由于生命倫理學問題往往對任何文化來說都是難題，生命倫理事件的全人類性和前沿性使得任何一個國家的文化傳統(tǒng)都不能獨善其身，也無法僅僅在自己的話語體系中提供一個可以被普遍接受的解決方案，故而取消了任何一種特殊文化的話語霸權(quán)。因此，以問題或難題為取向的生命倫理學研究，最有希望提供一個跨文化的倫理視野和論辯平臺，使不同觀點可以在生命倫理實踐中更平等、更自由、更深刻地進行對話交流，在屬于全人類的范疇內(nèi)進行廣泛的合作；在這些事件的啟發(fā)下重新審視我們的整個道德體系，判斷、描述并引導我們未來生活的應然。