商業(yè)計劃書感想精選(九篇)

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第1篇：商業(yè)計劃書感想范文

關(guān)鍵詞:紅花注射液;內(nèi)毒素;急性肝損傷;Bax Bcl-2;Bax/Bcl-2

中圖分類號:R285.5 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1673-7717(2010)01-0159-04

Effects of Safflower Injectionon on Bax Bcl-2 and Bax/Bcl-2 in Rats with

Acute Hepatic Injury

CHEN Ying1,HUANG Xiaomin2

(1.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053,Zhejiang,China;

2.Zhejiang Hospital of TCM,Hangzhou 310006,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:To observe the protective effects and mechanism of safflower injection (SI) on rats with acute hepatic injury (AHI) induced by endotoxin. Methods:80 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into ten groups, three SI treated groups, three reduced glutathione treated groups, three AHI model groups, and one control group. The rats were intraperitoneal-injected with Lipopolysaccharide (LPS) plus D-galactosamine (D-GalN) for modeling. The SI treated groups was injected SI into a tail vein, and the reduced glutathione treated groups was was injected reduced glutathione as the positive control. The blood from the abdominal vein and liver tissue samples were obtained at 6h, 24h and 48h after modles established. The contents of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were tested, the hepatic pathological changes were observed with hematoxylin-eosin (HE) stain, and the expression of Bax, Bcl-2 were detected by immunohistochemical studies. Results:Compared with the control group, serum levels of ALT and AST in rats of the model groups significantly elevats at 6h, 24h and 48h time points (P

Key words:SafflowerInjection; endotoxin; acute liver injury; Bax;Bcl-2; Bax/Bcl-2

紅花又名紅藍花、草紅花、刺紅花,藥用來源于雙子葉植物綱菊科一年生草本植物紅花CarthamustinctoriusL的筒狀花冠,始載于《開寶本草》,性味辛、微苦、溫,歸心、肝經(jīng),具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效?！侗静菥V目》記載紅花能“活血潤燥、止痛、散腫、通經(jīng)”,為內(nèi)、外、婦、傷各科血瘀證的要藥。紅花注射液是由中藥紅花中提取制備的滅菌水溶液,其主要成分是紅花黃色素(safflor yellow,SY)。研究證實:活血化瘀注射液可顯著提高內(nèi)毒素血癥大鼠生存率, 拮抗炎性細胞因子, 減輕肝細胞損傷, 對內(nèi)毒素血癥大鼠有一定的保護作用[1]。本實驗欲通過紅花注射液對LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠模型[2]大鼠的Bax、Bcl-2表達及其比值的影響,并與傳統(tǒng)護肝藥還原型谷胱甘肽對照,探討預(yù)防性給予紅花注射液對內(nèi)毒素性急性肝損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源 分組

清潔級雄性SD大鼠80只,體重(200±10)g(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供)隨機分為模型組、紅花注射液干預(yù)組(紅花組)、還原型谷胱甘肽干預(yù)組(TAD組)及空白對照組。模型組時相點設(shè)為6、24、48h,紅花注射液干預(yù)組、還原型谷胱甘肽干預(yù)組(TAD組)時相點同模型組;每時相點10 只動物;空白對照組10只動物。

1.2 實驗動物處理

模型組以腹腔注射LPS(Sigma公司)(50μg/kg)+D-GalN(Sigma公司)(300mg/kg)建立大鼠急性肝損傷模型;紅花組、TAD組在建模前0.5h分別以紅花注射液(生產(chǎn),批號071101)(2.5mL/kg)、還原型谷胱甘肽(商品名:泰特、TAD,意大利福斯卡瑪生化制藥公司生產(chǎn),批號37016/37003)(108mg/kg)尾靜脈注射1次。

1.3 標(biāo)本采集與處理

紅花組、TAD組、模型組分別于建模后各時相點及空白對照組在6h時3%戊巴比妥鈉(1mL/100g)腹腔注射麻醉,在無菌條件下腹腔靜脈取血4mL,離心分離血清,ElectroluxBCD-277雙溫冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ「巫笕~組織于10%中性甲醛溶液中固定,固定后的肝組織常規(guī)方法石蠟包埋、切片。

1.4 肝損傷指標(biāo)的測定

1.4.1 血清生化指標(biāo)測定使用日立7020全自動生化分析儀測定各實驗組大鼠ALT、AST水平。

1.4.2 肝組織病理切片 組織切片常規(guī)HE染色,光鏡下進行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 肝組織細胞的Bax Bcl-2表達

參照二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(上?；蚣夹g(shù)有限公司,兔抗鼠bax多克隆抗體、兔抗鼠bcl-2多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)推薦方法進行。計分標(biāo)準(zhǔn):每張切片隨機選取5個高倍視野(400倍),根據(jù)著色程度及著色細胞陽性范圍進行計算,著色程度:不著色者為0分,著色淡者為1分,中等著色為2分;著色深者為3分。著色細胞陽性范圍;無著色為0分,著色陽性細胞小于1/3為1分,著色陽性細胞1/3～1/2為2分,著色陽性細胞大于1/2為3分;將每張切片著色程度與著色細胞陽性范圍得分各自相加為其最后計分。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 13.0軟件進行分析,資料以±s表示,計量資料組間差異采用單因素方差分析,計數(shù)資料組間差異采用非參數(shù)的秩和檢驗,兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 光學(xué)顯微鏡下病理檢查

空白對照組大鼠肝組織光鏡下結(jié)構(gòu)完整、清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,無中性粒細胞浸潤,無肝組織細胞變性壞死現(xiàn)象;模型組大鼠肝組織6h切片可見炎細胞浸潤和點片狀壞死,24h切片肝組織結(jié)構(gòu)尚存,可見肝組織細胞腫脹、邊界模糊,肝組織細胞有大片狀壞死和多量炎細胞浸潤;48h切片肝組織小葉結(jié)構(gòu)紊亂,可見肝組織細胞壞死更加明顯,彌漫性炎細胞浸潤。紅花組及TAD組大鼠肝組織細胞壞死和炎細胞浸潤減少,肝組織細胞水腫減輕,肝小葉結(jié)構(gòu)接近空白對照組肝組織,其病理改變較模型組同時間點明顯減輕。

2.2 血生化檢測

模型組血清ALT、AST在6h開始增高,48h血清ALT、AST仍處于較高水平,各時間點測定均顯著高于對照組;紅花組及TAD組大鼠血清ALT、AST各時間點雖高于對照組,但明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

2.3 肝組織Bax Bcl-2蛋白表達 Bax Bcl-2陽性細胞表現(xiàn)為細胞漿棕黃色染色。

Bcl-2在大鼠肝組織主要表達在匯管區(qū)、肝竇、肝組織細胞的胞漿中;Bax在主要表達在肝組織細胞漿,其次在肝竇和中央靜脈有表達,見圖1、圖2?？瞻讓φ战M可見少量陽性表達;模型組各時間點Bax、Bcl-2蛋白明顯上調(diào),與空白對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(P

3 討 論

急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是指原來不存在肝硬化的病人在一種或多種較強的致病因素作用下,引起的急性、大量肝組織細胞壞死,或肝組織細胞內(nèi)細胞器嚴(yán)重功能障礙,在疾病發(fā)生26周內(nèi)出現(xiàn)肝功能迅速惡化,并導(dǎo)致精神異常及凝血障礙的一種臨床綜合征,具有相當(dāng)高的死亡率。ALF的發(fā)生是肝組織細胞的急性大量死亡不能為細胞增生所補償?shù)慕Y(jié)果[3]。研究證實急性肝衰竭患者肝組織細胞的死亡表現(xiàn)為凋亡和壞死, 而且凋亡是其主要的病理改變[4]。人體肝組織學(xué)檢查和動物實驗均證實了凋亡在急性肝損傷、肝衰竭的細胞死亡中起重要作用[5-6]?，F(xiàn)在認為,肝組織細胞凋亡是肝衰竭分子機制中最重要的事件[7]。

早在1995年韓德五就提出內(nèi)毒素血癥特別是腸源性內(nèi)毒素血癥是肝功能衰竭發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。內(nèi)毒素引起的臟器功能損傷和多器官功能障礙綜合征過程中,肝臟既是清除內(nèi)毒素的主要器官,同時也是內(nèi)毒素血癥時受損最早、最明顯的靶器官之一[9]。本實驗研究中,筆者采用LPS/D-GalN急性肝損傷大鼠模型。D-GalN為一種選擇性損害肝臟的藥物,能消耗肝細胞三磷酸尿酐(UTP),抑制RNA合成;促使肥大細胞脫顆粒釋放組胺,造成結(jié)腸水腫,使腸源性內(nèi)毒素吸收增加,增強小鼠對LPS的敏感性(約100 000倍)[10];而LPS與血清中的LPS結(jié)合蛋白(LBP)形成復(fù)合物, 與細胞膜上的結(jié)合受體CD14結(jié)合后, 在MD2等蛋白協(xié)同作用下, 由信號受體TLR4將信號傳導(dǎo)到胞內(nèi), 促進炎癥介質(zhì)IL-1、TL-6和TNF-α的釋放,導(dǎo)致肝組織細胞凋亡、壞死[11]。

ALT、AST為氨基酸代謝中的重要酶,在于肝組織細胞內(nèi)ALT主要分布于細胞漿內(nèi),AST分布于細胞漿和線粒體中,正常時血清內(nèi)含量很低,當(dāng)肝組織細胞受損傷時,細胞膜結(jié)構(gòu)破壞,即可從細胞內(nèi)逸出而進入血液循環(huán)中,此時血清ALT、AST較正常增高,在排除肝外臟器病變的情況下,血清ALT、AST在一定程度上反映了肝組織細胞損害和壞死的程度。本實驗中,模型組與空白對照組比較顯示:LPS在6h內(nèi)即造成了D-GalN致敏大鼠血清ALT、AST升高,且肝組織見炎細胞浸潤和點片狀壞死進行性加重,表明LPS+D-GalN可成功復(fù)制急性肝損傷。紅花注射液及還原型谷胱甘肽預(yù)處理的兩組大鼠肝臟的細胞壞死和炎癥程度均較模型組明顯降低,血ALT、AST均明顯下降,表明紅花注射液對內(nèi)毒素性急性肝損傷大鼠具有較好的保護作用,并于24h、48h時作用較明顯,且效果與還原型谷胱甘肽相當(dāng)。哺乳動物細胞凋亡是受Bcl-2蛋白家族、調(diào)節(jié)蛋白凋亡激酶激活因子1(Apaf-1)、caspase蛋白家族等調(diào)控的。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中兩個典型的抑凋亡和促凋亡蛋白,且二者通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡。當(dāng)Bax形成同源二聚體時誘導(dǎo)細胞凋亡;Bax與Bc1-2形成異源二聚體時則實現(xiàn)了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能[12]。Bax與Bcl-2的比值決定同源二聚體(Bax/Bax)與異源二聚體(Bcl-2/Bax)的比值,這對決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)有重要意義。這一家族蛋白在腫瘤中研究最多,證實了在1993年Korsmeyer就提出的假說:在外界因素刺激下細胞的生死最終取決于Bcl-2和Bax兩種調(diào)控因子的平衡結(jié)果[13],但在內(nèi)毒素性急性肝損傷中研究較少。本實驗中,免疫組化法檢測肝組織Bax、Bcl-2的表達結(jié)果顯示:模型組與空白對照組比較:在肝損傷程度加重的情況下Bax、Bcl-2表達均上調(diào)與以往研究中bax上調(diào), bcl-2下調(diào)[14],或bax上調(diào),bcl-2無顯著變化[15]并不完全一致,但是本實驗中Bax/Bcl-2上升與以往研究結(jié)果一致,由此筆者認為在內(nèi)毒素性急性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中,Bax/Bcl-2比值可能與肝損傷程度正相關(guān),Bax/Bcl-2可能是肝組織細胞凋亡動態(tài)變化的決定性因素之一。紅花組及TAD組與模型組比較:大鼠肝組織細胞Bax與Bcl-2表達及Bax/Bcl-2下降,表明紅花注射液對急性肝損傷大鼠的保護作用可能是通過下調(diào)Bax、Bcl-2蛋白的表達及降低Bax/Bcl-2比值,從而抑制肝組織細胞的過度凋亡來實現(xiàn)的,該途徑可能是其抗內(nèi)毒素性急性肝損傷的主要機制之一。

綜上所述,該實驗于6h內(nèi)即成功復(fù)制了內(nèi)毒素性急性肝損傷大鼠模型。紅花注射液可明顯保護LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝組織細胞損傷,此作用可能與Bax/Bcl-2比值降低,從而抑制肝組織細胞的過度凋亡有關(guān)。它為防治所致危重癥急性肝衰竭提供了新思路,并為臨床應(yīng)用紅花注射液防治急性肝損傷提供了部分理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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